Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme
Summary
Biz bir in vivo serebral korteks yenidoğan farelerin görüntüleme için protokol Imaging iki fotonlu mevcut. Bu yöntem kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için uygundur.
Abstract
İki fotonlu görüntüleme memeli beyinde nöronal devreler vivo çözümlenmesi için güçlü bir araçtır. Ancak, vivo içinde görüntüleme yöntemleri sınırlı sayıda canlı yeni doğan memeliler beyin dokusunun incelenmesi için bulunmaktadır. Burada yaşayan yenidoğan farelerde bireysel kortikal nöronlar görüntüleme için bir protokol özetler. Bu iletişim kuralı aşağıdaki iki yöntemleri içerir: (1 süpernova sistemi gelişmekte olan beyin ve kırılgan yenidoğan kafatası için (2) bir cerrahi işlem kortikal nöronların seyrek ve parlak etiketleme için. Bu iletişim kuralı bireysel kortikal neurites zamansal değişiklikleri gözlem yüksek sinyal gürültü oranı ile yenidoğan aşamaları sırasında sağlar. Etiketli hücre özel gen susturmak ve nakavt Ayrıca süpernova RNA müdahale ve CRISPR/Cas9 gen sistemleri düzenleme ile birleştirerek elde edilebilir. Bu iletişim kuralı böylece, kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir.
Introduction
Serebral korteks nöronal devreler kesin kablolama algı, biliş ve öğrenme ve bellek de dahil olmak üzere daha yüksek beyin fonksiyonları için önemlidir. Kortikal devreleri postnatal geliştirme sırasında dinamik olarak rafine. Çalışmalar histolojik kortikal devre oluşumu kullanarak işlemi ve vitro kültür analizleri araştırdı. Ancak, yaşayan memelilerde devre formasyonu dinamiği çoğunlukla keşfedilmemiş kalmıştır.
İki fotonlu mikroskobu yaygın yetişkin fare beyin1,2nöronal devreler vivo içinde analizleri için kullanılmıştır. Ancak, teknik sorunlar nedeniyle sınırlı sayıda çalışmalar nöronal devre oluşumu yeni doğan farelerde ele sahip. Örneğin, Carrillo vd. beyincik ikinci Doğum sonrası hafta3lifler tırmanma zaman hata görüntüleme yapılır. Portera-Cailliau vd. , akson kortikal katmanına 1 ilk Doğum sonrası hafta4görüntüleme bildirdi. Bu da çalışmanın, katman 4 kortikal nöronlar ve onların dendrites yenidoğan farelerde gözlem için bir protokol özetler. İki yöntemleri içerir, bu iletişim kuralını uygulayarak elde edilen sonuçlar bizim son yayın5‘ te rapor edilir. Öncelikle, süpernova vektör sistemi5,6 bireysel yenidoğan beyin nöronlarda etiketleme için kullanın. Süpernova sisteminde nöronal etiketleme için kullanılan floresan proteinler değiştirilebilir ve etiketli hücre özel gen nakavt ve düzenleme/nakavt analizleri da mümkündür. İkinci olarak, kırılgan yenidoğan farelerde beyin pencere hazırlanması için bir cerrahi işlem açıklanmaktadır. Birlikte, bu metodolojileri yenidoğan beynindeki bireysel nöronların vivo içinde gözlem izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İletişim kuralı kritik adımlar ve sorun giderme:
En kritik Protokolü’nün (iletişim kuralı adım 3.2) kafatası kaldırılması adımdır. Ekleme jilet kez dural kanama ve beynin zarar görmesi neden dura yapışır. Bu kafatasında bir damla korteks arabelleği ekleyerek ve kafatası korteks arabellekte kaldırarak önlenebilir.
Kafatası pencere hazırlık için pencerenin tıkanıklığı açar sonra dura ve cilt kanama. Bu doku önlemek için kullanılan ya …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar T. Sato, M. Kanbayashi ve S. Kouyama kendi teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser ve JSP’ler KAKENHI Grant numaraları JP15K14322 ve JP16H06143, Takeda Bilim Vakfı, Uehara Anıtı Vakfı ve işbirlikçi araştırma projesi, Niigata Üniversitesi beyin Araştırma Enstitüsü 2017-2923 (H.M.) tarafından desteklenmiştir KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 ve JP15H04263 ve Grant-in yenilik alanları “Dinamik düzenleme beyin fonksiyonu tarafından hurda & yapı sistemi,” bilimsel araştırma (JP16H06459) üzerinden MEXT (TI).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Autores | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Autores | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
Referências
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
