In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen
Summary
Wir präsentieren eine in Vivo zwei-Photon imaging-Protokoll für die Belichtung der Hirnrinde des Neugeborenen Mäusen. Diese Methode ist geeignet für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und die Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen steuern.
Abstract
Zwei-Photon Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die in-Vivo -Analyse der neuronalen Schaltkreise im Gehirn von Säugetieren. Jedoch gibt es eine begrenzte Anzahl von in Vivo bildgebende Verfahren für die Prüfung des Hirngewebes live Neugeborenen Säugetiere. Hier fassen wir ein Protokoll zur Aufnahme einzelner kortikaler Neuronen in lebenden Neugeborenen Mäusen. Dieses Protokoll enthält die folgenden beiden Methoden: (1) der Supernova-System zur spärlich und helle Beschriftung der kortikalen Neuronen in das sich entwickelnde Gehirn und (2) ein chirurgischer Eingriff für die fragile neonatale Schädel. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung des zeitlichen Veränderungen der einzelnen kortikalen Neuriten in neonatale Phase mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Beschriftete Zelle-spezifischen gen-silencing und Knockout können auch erreicht werden, indem die Supernova mit RNA-Interferenz und CRISPR/Cas9 gen Schnittsysteme. Dieses Protokoll kann so verwendet werden, für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen zu kontrollieren.
Introduction
Die genaue Verdrahtung von neuronalen Schaltkreisen in der Großhirnrinde ist unerlässlich für die höheren Hirnfunktionen wie Wahrnehmung, Kognition, und lernen und Gedächtnis. Kortikale Schaltungen werden während der postnatalen Entwicklung dynamisch verfeinert. Studien haben den Prozess der kortikalen Schaltung Bildung mit histologischen und in-vitro- Kultur-Analysen untersucht. Allerdings hat die Dynamik der Schaltung Bildung in lebenden Säugetieren meist unerforscht.
Zwei-Photonen-Mikroskopie hat für die in Vivo -Analyse der neuronalen Schaltkreise im Gehirn Erwachsener Mäuse1,2verbreitet worden. Aufgrund technischen Herausforderungen, haben jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Studien neuronale Schaltkreis Bildung bei Neugeborenen Mäusen angesprochen. Carrillo Et Al. durchgeführt zum Beispiel die Zeitraffer-Bildgebung des Kletterns Fasern im Kleinhirn im zweiten postnatalen Woche3. Tür-Cailliau Et Al. berichteten die Bildgebung der Axone in kortikalen Schicht 1 in der ersten postnatalen Woche4. In der vorliegenden Studie fassen wir ein Protokoll für die Beobachtung der Schicht 4 kortikalen Neuronen und ihre Dendriten bei Neugeborenen Mäusen. Ergebnisse, die durch die Anwendung dieses Protokolls, die zwei Methoden umfasst, werden in unseren jüngsten Veröffentlichung5gemeldet. Erstens verwenden wir die Supernova Vektor System5,6 zur Kennzeichnung einzelner Neuronen im neonatalen Gehirn. Im Supernova System fluoreszierende Proteine verwendet für die neuronale Kennzeichnung sind austauschbar und beschriftete Zelle-spezifischen gen-Knockdown und Bearbeitung/ko Analysen sind ebenfalls möglich. Zweitens, beschreiben wir einen chirurgischen Eingriff für die Vorbereitung der kranialen Fenster in fragilen Neugeborenen Mäusen. Zusammen ermöglichen diese Methoden die in Vivo -Beobachtung von einzelnen Neuronen im neonatalen Gehirn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wichtige Schritte im Protokoll und Fehlerbehebung:
Der wichtigste Schritt des Protokolls ist die Entfernung des Schädels (Protokoll Schritt 3.2). Beim einsetzen hält sich die Rasierklinge häufig an der Dura, durale Blutungen und Schädigung des Gehirns verursacht. Dies kann vermieden werden, durch Hinzufügen von einen Tropfen des Kortex Puffer auf den Schädel und Entfernen des Schädels im Kortex Puffer.
Blutungen aus der Dura und der Haut nach der kranialen Fenst…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken T. Sato, M. Kanbayashi und S. Kouyama für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Zuschuss Zahlen JP15K14322 und JP16H06143, der Takeda Science Foundation, Uehara Memorial Foundation und das kollaborative Forschung Projekt von Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M) und unterstützt. KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, und JP15H04263 und Grant-in wissenschaftliche Forschung auf Innovationsfelder “Dynamische Regelung der Funktion des Gehirns von Schrott & Build-System” (JP16H06459) von MEXT (TI).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Autores | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Autores | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
Referências
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
