I djurens utveckling måste hundratals, tusentals, miljoner, miljarder, eller ens biljontals celldelningar bilda den vuxna organismen. Cellcykeln, uppsättningen cellulära händelser sammansatt av G1 (gap), S (syntes), G2 (gap), och M (Mitos) definiera serien av händelser som avrättas varje celldelning. Cellcykeln är dynamisk och bäst uppskattat i realtid, vilket kan vara tekniskt svårt. De tekniker som presenteras i detta protokoll tillåter en att göra mätningar av faser och timing av cellcykeln från stillbilder.

Märkning med nukleosid analoger såsom 5-ethynyl-2′-deoxiuridin (EdU) eller 5-brom-2′-deoxiuridin (BrdU) är den gyllene standarden att identifiera S-fas i studierna av cellcykeln dynamik i den Caenorhabditis elegans (C. elegans) vuxen hermafrodit könsceller^1,2,3,4,5. Både EdU och BrdU kan användas i nästan alla genetiska bakgrund, som de inte lita på någon genetisk konstruktion. Visualisera BrdU kräver hård kemisk behandling att exponera antigenet för anti-BrdU-antikropp som färgning, och som ofta är oförenligt med bedömningen av andra cellulära markörer visualiseras genom samtidig färgning med ytterligare antikroppar. Däremot visualisera EdU sker genom att klicka på kemi under milda förhållanden och således är kompatibel med antikropp Co färgning^6,7.

Noggrannheten av etiketten är tydlig, eftersom atomkärnor endast införliva de tymidin (5-ethynyl-2′-deoxiuridin) analoger DNA under S-fasen. Visualisering sker i fasta vävnad. EdU etiketten är osynliga i sig fram till en som innehåller natriumazid färgämne eller fluorophore reagerar kovalent med alkynen i EdU av koppar-katalyseras Klicka kemi⁸. EdU märkning kan ge omedelbar information som kärnorna är i S-fas, med en kort puls av märkning. EdU kan också ge dynamisk information, med puls-chase eller kontinuerlig märkning; till exempel i en puls-chase experiment, etiketten späds vid varje celldelning eller sprids som nondividing celler framsteg genom utveckling.

I C. elegans hermafrodit könsceller är en kraftfull modellsystem för studier av signalering vägar, stamceller, meios och cellcykeln. Den vuxna könsceller är en polariserad montering-line med stamceller som finns på den distala änden följt av intrade och progression genom meiotisk profas, samordnas med stadier av könscellsbildning mer proximalt (figur 1). På den proximala änden, oocyter mogen, är ägglossning och befruktas och påbörja embryogenes i livmodern^9,10,11. ~ 20 cell-diameter lång regionen nära cellen distala spets, som omfattar mitotiskt cykling könsceller stammen, stamceller och meiotiska S-fas celler men inte cellerna i meiotiska profas, kallas stamceller zon^{2,4 , 9 , 12}. cellmembranen ge ofullständig separation mellan atomkärnor i den distala könsceller, men de zon stamceller genomgå mitotiska cell cykling till stor del självständigt. Könsceller stamceller zon i unga vuxna hermafroditer varar median mitotiska cellcykelns ~6.5 h; G1-fasen är kort eller frånvarande, och rofylld inte iakttas^1,2,13. Könsceller stamcellers differentiering sker genom i huvudsak direkt differentiering och därmed saknar transit-förstärkande divisioner⁴. Under differentiering i pachytene scenen, cirka 4 av 5 kärnor bildar inte oocyter men istället genomgå apoptos, agerar som sjuksköterska celler genom att donera sina cytoplasmiska innehållet till utveckla äggcellen^{12,14 , 15}.

Förutom märkning celler i S-fas med nukleosid analoger, kan man identifiera cellerna i Mitos och meios använder antikropp färgning. Kärnorna i Mitos är immunreaktiva till anti-phospho-Histon H3 (Ser10) antikropp (kallas pH3)^7,16. Kärnorna i meios är immunreaktiva till anti-honom-3 antikropp (meiotisk kromosomanalys axis protein)¹⁷. Kärnor i zonen stamceller kan identifieras genom avsaknad av HIM-3, förekomsten av nucleoplasmic REC-8¹⁸eller förekomsten av WAPL-1¹⁹. WAPL-1 intensitet är störst i den somatiska gonad, hög i den perifera zonen, och låg under tidig meiotiska prophases¹⁹. Flera cellcykeln mätningar är möjliga med några variationer i protokollet: jag) identifiera kärnor i S-fas och mäta S-fas index; (II) identifiera kärnor i M-fas och mäta indexet M-fas; (III) avgöra om kärnor var i mitotiskt eller meiotiska S-fas; IV) mäta längden på G2; V) åtgärd duartion G2 + M + G1 faser; VI) mäta graden av meiotiska inresa. VII) uppskatta graden av meiotiska progression.

Man kan göra flera cellcykeln mätningar från endast ett fåtal typer av våt-lab experiment. Protokollet nedan beskriver en 30 min puls märkning av utfodring C. elegans vuxen hermafroditer med EdU märkt bakterier och samtidig märkning M-fas celler genom färgning med anti-pH3 antikropp och perifera zonen celler genom färgning med anti-WAPL-1 antikroppar. Endast förändring varaktigheten av EdU foder (steg 2,5), typ av antikroppar sysselsatt (steg 5), och analyser (steg 8,3) krävs för ytterligare mätningar.