Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme
Summary
Düğüm ve notochordal plaka gelişmekte olan çeşitli teknikler kullanarak görüntülenir fare embriyo organizatörler sinyal geçici. Burada, biz iki çalışma onların yapısı ve morfogenetik bozmak nasıl ayrıntılı olarak tarif: 1) Tarama elektron mikroskobu (SEM); ve 2) bütün Dağı ayirt (WMIF).
Abstract
Sonrası implantasyon fare embriyo büyük şekil değişikliklerini gastrulasyon ve morfogenetik başlanmasından sonra uğrar. Morfogenez geçici organizatörleri, düğüm ve ilkel çizgi geçti hücrelerden notochordal plaka oluşumunu özelliğidir. Bu sinyal gönderme merkezlerinin uygun oluşumu vücut planı gelişimi için önemlidir ve teknikleri onları görselleştirmek için fare gelişimsel biyologlar yüksek ilgi. Düğüm ve notochordal plaka gastrulating fare embriyo embriyonik gün (E) kalkınma 7.5 ventral yüzeyinde yalan. Düğüm olan hücreleri bir tek ince cilium her sahip Kupası şeklindeki bir yapıdır. Uygun hücre altı yerelleştirme ve düğüm çukurunda kirpikler döndürme-sol asimetri belirler. Notochordal plaka hücreleri daha kısa da olsa bu düğüm hücrelerinin daha tek kirpikler de sahip olmak. Notochordal plaka somitogenesis ve sinirsel desenlendirme için önemli bir sinyal düzenleyici görevi gören notochord oluşturur. Düğüm ve notochordal plaka hücrelerinin yüzeyinde geçici varsa ve kirpikler sahip çünkü onlar Tarama elektron mikroskobu (SEM) kullanarak görüntülenmeyecektir. Görselleştirmek için kullanılan diğer teknikler arasında bu yapıların hücresel düzeyde son derece düğüm ve notochordal plaka ifade edilir proteinler karşı antikor kullanarak bütün Dağı ayirt (WMIF) olduğunu. Bu raporda, SEM ve düğüm ve notochordal plaka WMIF doku şekli ve vahşi-türü hücresel kuruluşta değerlendirmede yardımcı olmak için gelişmekte olan fare embriyo ve gastrulasyon mutant embriyo gerçekleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bizim iletişim kurallarını açıklar.
Introduction
Gastrulasyon ve beraberindeki morfogenetik hareketleri fare embriyo1şekillendirme için önemlidir. Hücresel şekli ve organizasyon morfogenez sırasında değişiklikleri hücre kader düzenleyen ve tam olarak yeni kurulan mikrop katmanlar1çeşitlendirmek için onların işlevleri gerçekleştirmek takip eden sinyal yollar sağlamak konumsal bilgi dikte. Gelişim programı2yürütülmesi için gerekli geçici yapıları düzenleme ve merkezleri düğüm ve notochord gibi sinyal oluşumdur. Gelişimsel biyologlar morfogenez bu yapıların en önemli hücresel gazetecilere ve canlı ex vivo hücre ve hücre altı davranış2 dinamikleri takip için görüntüleme kullanımı olduğu eğitim için çeşitli teknikler kullanmış ,3,4. Bu raporda, biz iki bu teknikler için en iyi duruma getirilmiş Protokolümüze ayrıntılarını açıklayan üzerinde odaklanmak: scanning elektron mikroskobu (SEM) ve bütün Dağı ayirt (WMIF), ve morfogenetik düğüm eğitim hala enstrümantal ve notochordal plaka, notochord habercisi.
Fare embriyonik düğüm gastrulasyon ve morfogenetik (embriyonik gün, E7.5-E8) sırasında geç baş kat aşamaları için erken etrafında fare embriyo ventral yüzeyinde bulunan bir gözyaşı damlası şeklindeki hücreler, bu,2,5, 6,7. Notochordal plaka morfolojik anteriorly düğüm3hayran kalacaksınız. Düğüm ve notochordal plaka her hücrede hangi düğümü hücrelerinde uzundur ama uzunluğu ile gelişimsel sahne2değişir dışına çıkıntı bir tek cilium karakterizedir. Kirpikler düğüm çukurunda dönüşü-sol asimetri4belirleyen sinyal için önemli olduğu gösterilmiştir. Notochordal plaka notochord bitişik somites ve üstteki nöral tüp3desenlendirme için önemlidir sinyal merkezi öncüsüdür.
Konum (yüzey), şekil (kupa) ve farklı dış hücresel yapılar (kirpikler) sahip özniteliklerini nedeniyle SEM düğüm ve notochordal plaka görselleştirmek ve onların oluşumu ve yapısı2, çalışma için geleneksel olarak kullanılmıştır 7. SEM de düğümü kendisini veya gastrulasyon, morfogenez gibi kirpikler oluşumu8,9,10etkiler mutasyonlar hücrelerine üzerinde kirpikler yapısını değişiklikleri incelemek için kullanılır. SEM odaklanmış ışın demeti elektron topolojik ultrastructure biyolojik örnekler11gibi malzemelerin dış yüzeyinin sorgulamaya kullanan bir tekniktir. Örnek genellikle sabit, kurutulmuş ve sonra sputter-metaller gözlem bir taramalı elektron mikroskobu altında için adım 1’de tarif olarak kaplanmış.
WMIF gen ürünleri, proteinler, üç-boyutlu (3D) gibi görselleştirmek için boyama bir tekniktir. WMIF dokuları, organları veya hatta bütün organizmalar kayma dağıtım işaret ve şekli 3D elde edilen yapısının Kılavuzu. Teknik sonra floresan conjugates ile boyama örnek gidermek için temel alır. Fare embriyo ~ E7.5 küçük ve şeffaf ve bu nedenle düğüm ve notochordal plaka görselleştirmek WMIF iletişim kuralları için ideal. Örneğin, Barchyury (T) çekirdek düğüm ve notochordal plaka ve daha az bir ölçüde de E7.5-E8 embriyonik gelişim ve T WMIF tarafından karşı iyi çalışma antikor çevresinde ilkel çizgi ile ifade edilir transkripsiyon faktörü olan ticari olarak kullanılabilir ve boyama işlemi mümkün kılar. Düğüm ve notochordal plaka hücreleri de dış yüzü ve böylece ile floresan Birleşik Phalloidin işaretine F-aktin, apikal boğumların boyanabilen dar apikal yüzeylerinde karakterizedir. Adım 2 8‘ göstermek gibi bu reaktifler örnek olarak kullanarak, T ve F-aktin WMIF tarafından boyama düğüm ve 3D notochordal tabak gastrulating fare embriyosu içinde bir gösterimini sağlar. Ancak, kirpikler, ARL13B veya acetylated tübülin yanı sıra düğümü ve notochordal plaka, FOXA2 gibi diğer işaretleri gibi işaretleri WMIF gelişmekte olan fare embriyo3,4üzerinde gerçekleştirmek için de kullanılabilir.
Striatin-etkileşim protein 1 (STRIP1) normal gastrulasyon ve morfogenetik fare embriyo8için gerekli olduğunu göstermiştir. STRIP1 striatin-etkileşim fosfatazlar ve kinazlar kompleksleri (STRIPAK), biz ve diğerleri içinde aktin sitoiskeleti organizasyon8,12karıştığı bir çekirdek bileşenidir. Bir büyük Strip1 mutant embriyo aksiyel mesoderm (düğüm ve notochordal plaka) oluşumu ve uzantısı antero-posterior vücut eksen kusurdur. SEM ve WMIF Temsilcisi sonuçları ve karşılık gelen rakamlar gösterdiği gibi düğüm ve vahşi-tipi (WT) ve Strip1 mutant embriyo notochordal plaka analiz etmek için kullandım.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, SEM ve WMIF fare embriyonik düğüm ve notochordal plaka görselleştirmek için gerçekleştirmek nasıl gösterir. Gastrulating fare embriyo küçük boyutunu ~ E7.5 ve bu yapıların yüzeyi varlığı teknikleri açıklanan2,7,8kullanarak eğitim ideal yapan. T ve kirpikler işaretleri gibi iyi antikorlar kullanılabilirliğini yapısı, organizasyonu ve bu temel embriyonik organizatörler8oluşumu WMIF kullanarak mükemmel 3D bilgileri verir.
Fare embriyonik gelişim çok hızlı bir tempoda devam eder ve düğüm ve notochordal plaka sadece geçici embriyo yüzeyinde mevcut oldukları için zamanlama bu deneyler2,3başarı için önemlidir. Örneğin, 2-4 somite embriyo olgun düğüm çukur uzun kirpikler ile SEM çözümlenmesi için iyidir. Çok daha erken ya da daha sonra embriyo (örneğin, 12 h önce veya sonra), düğüm yüzeyinde mevcut olmayabilir. WMIF bu konuda biraz daha esnek ama yapıları kendilerini geliştirme sırasında da geçici ve zamanlama Bu durumda araştırmacıların çıkarları üzerinde bağlıdır.
Reaktifleri saflığı da bu tekniklerin başarısı için çok önemlidir özellikle embriyolar için genellikle sopa SEM Tiny yabancı maddeler tarafından ultrastructure sondalama içinde büyük aktarımında neden.
Embriyo fiksasyon SEM bir için iki farklı yöntem test ettiğimiz yarım Karnovsky’nın sabitleştirici (% 2.5 oxazolidin, % 2 paraformaldehyde ve 0.1 M cacodylate arabellek) ve basit bir % 2.5 oxazolidin 1 x PBS kullanarak. 1. adımda açıklandığı gibi PBS sabitleştirici ve oxazolidin kullanmayı tercih, ancak, biz ve diğerleri de yarım Karnovsky’nın sabitleştirici başarıyla SEM için kullandık
Ayrıca SEM için embriyo kurutma için iki yöntem karşılaştırıldığında ve kritik nokta kurutma makinesi veya 1. adımda açıklandığı gibi HMDS kullanarak örnek kalitesini fark bulundu ve başka bir yerde14bildirdi.
Adım 2 için test ettik % 1 düşük erime özel son yıkama adımda bir 35 mm cam alt çanağı monte sonra embriyo yerleştirmesi ve sonra onunla Tepesi ~ 10 µL montaj orta. Bu gömme yöntemi çalışır ve embriyo orijinal 3D yapısı ve ilişkili yapıları korur; Ancak, multiphoton mikroskop düzenli confocal mikroskop sağlam embriyo derin ulaşamıyorum çünkü örnek görüntü için gereklidir (~ 1 mm).
Biz bu iki teknikleri kullanarak normal gelişim sırasında ve bu yapıların oluşumuna hataları gösteren mutantlar tamamlayıcı bilgileri yapısı düğümü ve notochordal plaka üzerinde verir inanıyorum.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HB Tıp Fakültesi ve SFB829 Köln Üniversitesi başlangıç fon tarafından desteklenir. C.X. DFG tarafından desteklenmektedir BA 5810/1-1 izni. CECAD araştırma merkezi ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi (New York, ABD) görüntüleme olanakları teşekkür etmek istiyorum. Joaquín Grego-Bessa (İspanyolca ulusal merkezi kardiyovasküler araştırma, Madrid, İspanya) embriyo WMIF için montaj üzerinde onun anlayış için teşekkür ediyoruz.
Materials
| 1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
| Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
| Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
| SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
| SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |
Referências
- Rivera-Pérez, J. A., Hadjantonakis, A. K. The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).
- Lee, J. D., Anderson, K. V. Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse. Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).
- Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions. Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).
- Yoshiba, S., et al. Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2. Science. , (2012).
- Jurand, A. Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).
- Poelmann, R. E. The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo. Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).
- Sulik, K., et al. Morphogenesis of the murine node and notochordal plate. Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).
- Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).
- Bazzi, H., Anderson, K. V. Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).
- Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- McMullan, D. Scanning electron microscopy 1928-1965. Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).
- Bai, S. W., et al. Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration. BMC Biology. 9, (2011).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition. Cold Harb Lab Press. , (2014).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186, 84-87 (1997).
