Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

Todos los experimentos que involucran animales de experimentación fueron aprobados por las autoridades responsables en Westfalia Rhein (LANUV-NRW). 1. microscopía electrónica del nodo embrionario de ratón Sacrificar el ratón hembra embarazado en ~ E7.5 (2-4 etapa de somite) por dislocación cervical. Una explicación detallada con los diagramas de pasos 1.1 – 1.7 está disponible en embrión de ratón laboratorio manuales13. Abrir el abdomen a través de la piel y entresijos y extirpar el útero, usando tijeras y pinzas finas. Enjuague el útero brevemente en agua destilada y colóquelo en un plato pequeño de Petri limpia (6 cm) que contiene 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Bajo un microscopio de disección y con unas pinzas finas, retire los músculos uterinos para los sitios de implantación o deciduae individuales. Sujete cada decidua con un par de pinzas y usar el otro par para hacer una incisión longitudinal de espesor total entre la parte roja (futura placenta) y la parte blanca (donde se encuentra el embrión). Hacer perforaciones superficiales verticalmente a lo largo de la parte blanca de la decidua contiguo con la incisión. Separe la decidua horizontalmente en dos mitades y con cuidado sacar el embrión en la parte blanca de la decidua. Transferir el embrión a una nueva placa de Petri (35 mm) con PBS estéril filtrada fresca. Repita para todos deciduae embriones. Membrana de Reichert, una membrana relativamente opaca que envuelve el embrión, de cada embrión de burlas como un calcetín a partir del cono de ectoplacental (sitio de la implantación de color rojizo). Por genotipificación, tome un pedazo pequeño (~ 0,1 mm2) de la vesícula vitelina en esta etapa. Bajo una campana química y usar protección adecuada (guantes), transferir los embriones a EM grado fijador compuesto por glutaraldehído al 2.5% en PBS estéril filtrado en un tubo de microcentrífuga (1.5 mL) a temperatura ambiente. Fijar los embriones durante la noche a 4 ° C. Retirar el fijador de glutaraldehido del tubo sin tocar los embriones cuidadosamente y deseche en un contenedor de residuos adecuado. Lavar los embriones tres veces en PBS estéril filtrada, durante 15 min a temperatura ambiente. Deshidratar los embriones en una serie de etanol de 5 minutos cada uno: 50%, 70%, 85% y tres veces en 100% o etanol absoluto. Almacenar los embriones a −20 ° C en etanol o vaya directamente al paso siguiente. Transferencia de los embriones en etanol a cestas para punto crítico (CPD) de secado en una secadora de punto crítico. Llene la cámara con etanol para cubrir completamente las cestas. Intercambiar el etanol por cuidadosamente lavado con líquido de CO2 por diez veces a 10 ° C. Drena líquido CO2 después el último paso hasta que la cámara está medio llena. Calentar hasta 40 ° C hasta que la presión alcanza 80 bares (el punto crítico) y el líquido CO2 cambia a gas. Espere 10 minutos y luego lentamente soplar el gas por aproximadamente 45 minutos. Como una alternativa más fácil para CPD para secar, añadir hexamethyldisilazane (HMDS) en una proporción de 1:1 a los embriones en etanol durante 30 minutos. Luego transferir los embriones a HMDS puro durante 30 minutos retirar los embriones en el líquido con una pipeta y dejarlos secar durante 30 minutos.Nota: Ambos métodos de secado trabajaban igualmente bien en nuestras manos. Use un pincel fino para montar los embriones secos con el lado ventral (nodo) para arriba en un trozo de SEM con cinta de doble cara. Inserte los talonarios con los embriones en una máquina de recubrimiento sputter para la capa de la partícula del oro, que es preferida para cargar los cilios largo y finos. Aplicar una capa de 120-150 Å; el tiempo depende de la corriente, que variará con cada muestra. Coloque los talones revestidos con los embriones en un microscopio SEM, aplicar vacío y observe el nodo embrionario y las células de la placa notocordal con cilios con aumentos que van desde 1000 X hasta 15, 000 X. 2. todo inmunofluorescencia de montaje de la placa notocordal y nodo de ratón Con PBS helado con 0,05% Tween 20 (PBSTw), siga los pasos 1.1-1.7 arriba para sacar los embriones en E7.75 y en PBSTw en una placa de Petri en el hielo de 35 mm. Bajo una campana química y usar protección adecuada (guantes), transferencia de los embriones en una solución fijadora de paraformaldehído al 4% en PBS en un tubo de microcentrífuga. Fijar los embriones durante la noche a 4 ° C. Retirar el fijador de paraformaldehido del tubo sin tocar los embriones cuidadosamente y deseche en un contenedor de residuos adecuado. Lavar los embriones tres veces en PBS que contenía 0,2% Tritón X-100 (PBSTr) por 5 min a temperatura ambiente. Realizar el lavado y pasos de incubación en un agitador oscilante. Retirar el último lavado y añadir solución de bloqueo que contiene PBSTr con 10% de suero inactivado con calor (de la especie del anticuerpo secundario). Bloque de 2 h durante la noche (o más) en un nutator a 4 ° C. Retirar el bloqueo y añadir ~ 1 mL del anticuerpo primario diluido en solución, por ejemplo, un anticuerpo anti-T en dilución 1: 500 de bloqueo. Incubar durante la noche (o más) en un nutator a 4 ° C. Quitar el anticuerpo primario y guardarlo para utilizarlo más adelante agregando azida sódica a una concentración final de 0,02% (1 μl del stock de 20% a 1 mL de solución de anticuerpo). El anticuerpo puede ser reutilizado ~ 10 veces. Enjuague los embriones dos veces con PBSTr y luego lavarlos tres veces durante 30 minutos cada uno en un nutator a 4 ° C. Sustituir el lavado con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia, contra la especie primaria del anticuerpo, diluido en ~ 1: 1000 durante la noche (o más) en un nutator a 4 ° C. Quite el anticuerpo secundario y enjuague dos veces con PBSTr, a continuación, lave tres veces durante 30 minutos con PBSTr. Vuelva a colocar el último lavado con PBSTr que contienen phalloidin conjugado fluorescencia de 1: 500, a la mancha F-actina y 1: 1000 DAPI, para teñir los núcleos, por 1 h a temperatura ambiente. Enjuague dos veces en PBSTr y lavar una vez con PBSTr por 30 min a temperatura ambiente. Reemplace PBSTr con PBS y dejar los embriones en el hielo. Preparar portaobjetos limpio cargado positivamente (60 x 24 mm) y cubreobjetos (24 x 24 mm) y los medios de medio de montaje acuoso basados en glicerol, por ejemplo, 90% de glicerol en 1xPBS y un reactivo antifade, montar los embriones. Poner dos trozos de cinta adhesiva transparente a una distancia de ~ 15 mm uno del otro en la parte clara de la diapositiva. Esto creará suficiente espacio 3D (en la dimensión Z) que permita acoplar los embriones pero no totalmente exprimirlos. Con un microscopio de disección, mueva cuidadosamente los embriones utilizando una pipeta de P200 corte (para permitir suficiente espacio para que el embrión a transferir y no dañado) a la diapositiva. Con unas pinzas finas, hacer dos cortes completos en los laterales de la vesícula vitelina a desarrollarse el embrión. Coloque el embrión con el lado ventral (nodo y placa notocordal) para arriba (dorsal del tubo neural en la diapositiva). Añadir 50 μl de medio de montaje sobre el embrión. Coloque los embriones de 4-5 por diapositiva. Añadir un poco de montaje de los medios de comunicación al lado del cubreobjetos que primero toque la corredera (lado superior o inferior), luego coloque a caballo entre los dos trozos de cinta y bájela lentamente hasta los embriones con pinzas finas o una aguja fina doblada evitando crear burbujas de aire. Limpiar los medios de montaje exceso utilizando un paño absorbente. Tenga cuidado de no mover el cubreobjetos en el proceso. Con una generosa cantidad de esmalte de uñas, sella los lados del cubreobjetos sin moverla. Observar bajo un microscopio de barrido confocal.