Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции
Summary
Notochordal пластины и узлов являются временными, сигнализации организаторы в развитии эмбрионов мыши, которые могут быть визуализированы с помощью нескольких методов. Здесь, мы подробно описывают, как выполнять два из методов, чтобы изучить их структуру и Морфогенез: 1) растровая электронная микроскопия (SEM); и 2) вся гора иммунофлюоресценции (WMIF).
Abstract
Мыши после имплантации эмбриона претерпевает изменения основных формы после начала гаструляция и морфогенеза. Отличительной чертой морфогенеза является формирование переходных организаторов, узел и notochordal плиты, из клеток, которые прошли через примитивных полоска. Надлежащее формирование этих сигналов центров имеет важное значение для разработки плана тела и методы, чтобы визуализировать их представляют большой интерес для развития биологов мыши. Узел и notochordal плиты лежат на вентральной поверхности gastrulating эмбрионов мыши вокруг эмбриональных день (E) 7.5 развития. Узел является структурой Чашеобразная, клетки которых имеют одну стройную ресничку. Правильной субцеллюлярные локализации и вращение реснички в яму узла определяет асимметрия слева направо. Notochordal плита клетки также обладают одной реснички хотя короче, чем те из узла клеток. Notochordal плита образует хорда, которое выступает организатором важных сигналов для somitogenesis и нейронных патронирования. Потому что клетки узла и notochordal пластины временно присутствуют на поверхности и обладают ресничек, они могут быть визуализированы с помощью растровая электронная микроскопия (SEM). Среди других методов, используемых для визуализации этих структур на клеточном уровне является вся гора иммунофлюоресценции (WMIF) с использованием антител против белки, которые сильно выражены в узел и notochordal пластины. В настоящем докладе мы описываем наши оптимизированные протоколы для выполнения SEM и WMIF узла и notochordal пластины в развивающихся эмбрионов мыши чтобы помочь в оценке формы тканей и клеточных Организации в одичал типа и мутантов гаструляция эмбрионов.
Introduction
Решающее значение для формирования зародыша мыши1гаструляция и сопровождающих морфогенетических движений. Изменения в клеточных фигуры и Организации в ходе морфогенеза диктовать информацию для регулирования судьбу клеток и также позволяют последовавшей сигнальные пути точно выполнять свои функции по диверсификации новообразованной зародышевых1. Формирование переходных структур Организации и сигнализации центров, таких как узел и хорда имеет важное значение для выполнения программы развития2. Развития биологов использовали различные методы для изучения морфогенез этих структур, наиболее заметным из которых является использование сотовой репортеров и живой ex vivo изображений следовать динамику в клеточном и субклеточном поведение2 ,3,4. В настоящем докладе, мы ориентируемся на с подробными сведениями о нашем оптимизирован протоколов для двух из этих методов: сканирование электронная микроскопия (SEM) и вся гора иммунофлюоресценции (WMIF), которые были и по-прежнему важную роль в изучении морфогенез узла и notochordal плиты, предшественник хорда.
Мыши эмбриональные узел является каплевидные Кубок клеток, который расположен на вентральной поверхности эмбриона мыши вокруг начала в конце головы фолд стадии во время гаструляция и морфогенез (эмбриональных день, E7.5-E8)2,5, 6,7. Notochordal плита морфологически кпереди исходит от узел3. Каждая ячейка в узел и notochordal плиты характеризуется одну ресничку, что выступает наружу, который длиннее в клетках узел, но длина которого изменяется в зависимости от стадии развития2. Вращение реснички в узел яму было показано, быть важным для сигнализации, определяющий левый правый асимметрия4. Notochordal пластина является прекурсором хорда, сигнальный центр, который имеет важное значение для патронирования соседние сегменты и вышележащих Нервная трубка3.
Поскольку атрибуты расположения (поверхности), формы (Кубок) и обладающие собственный внешний клеточных структур (реснички) SEM традиционно используется для визуализации узла и notochordal пластины и изучить их формирования и структуру2, 7. МДж также используется для изучения изменений в структуре самого узла или ресничек на клетки в мутаций, затрагивающих гаструляция, морфогенез, а также реснички формирования8,9,10. SEM это техника, которая использует фокусированный луч электронов допрос топологических Ультраструктура внешней поверхности материалов, таких как биологические образцы11. Этот образец обычно фиксированной, сушат и затем распыления покрытием с металлами для наблюдения под сканирующий электронный микроскоп, как мы описали в шаге 1.
WMIF является методом окрашивания визуализировать гена продуктов, таких как белки, в трех измерениях (3D). WMIF тканей, органов или даже целых организмов обеспечивает пространственной информации о распределении сигнала и форму результирующей структуры в 3D. Методика основана на фиксации образца, затем окрашивание с флуоресцентные конъюгатов. Мышь эмбрионов ~ E7.5 являются небольшими и прозрачным и поэтому идеально подходит для WMIF протоколы для визуализации узла и notochordal пластины. К примеру транскрипционный фактор, который Barchyury (T) выражается в ядрах узла и notochordal плиты и в меньшей степени в примитивных полоска, вокруг E7.5-E8 эмбрионального развития и хорошей рабочей антител против T WMIF являются коммерчески доступные и сделать возможным пятная процедуру. Клетки узла и notochordal пластины характеризуются свёрнутые апикальной поверхности, которые сталкиваются снаружи и таким образом могут быть окрашены с конъюгированных флуоресценции Фаллоидин знак F-актина в апикального сужения. Используя в качестве примеров этих реагентов, комбинация T и F-актина, окрашивание, WMIF обеспечивает представление узла и notochordal пластины в 3D в gastrulating эмбрионов мыши как мы показываем в шаге 8. Однако маркеры реснички, таких как ARL13B или ацетилированный тубулин, а также другие маркеры узла и notochordal плиты, таких как FOXA2, могут также использоваться для выполнения WMIF мыши развивающиеся эмбрионы3,4.
Мы показали, что striatin взаимодействия протеин 1 (STRIP1) имеет важное значение для нормального гаструляция и морфогенез в эмбриона мыши8. STRIP1 — это основной компонент striatin взаимодействующих фосфатаз и киназы комплексов (STRIPAK), которые мы и другие причастны актина цитоскелета организации8,12. Дефект Strip1 мутант эмбрионов в основных находится в формировании осевой мезодермы (узел и notochordal плиты) и расширение тела Антеро задней оси. Мы использовали SEM и WMIF для анализа узел и notochordal пластины в одичал тип (WT) и Strip1 мутант эмбрионов, как мы покажем в Представитель результаты и соответствующие показатели.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе мы продемонстрируем выполнять SEM и WMIF для визуализации эмбриональных узел мыши и notochordal пластины. Небольшой размер gastrulating эмбрионов мыши ~ E7.5 и присутствие этих структур на поверхности делают их идеальными для исследования с использованием методов описанных2,7,8. Наличие хорошей антител, такие как маркеры T и реснички, дает отличную 3D информацию, используя WMIF на структуры, Организации и формирования этих основных эмбриональных организаторы8.
Потому что мышь эмбрионального развития продолжается очень быстрыми темпами, и узел и notochordal пластины присутствуют только временно на поверхности эмбриона, время имеет важное значение для успеха этих экспериментов2,3. Например 2-4 Сомит эмбрионов хороши для SEM анализ зрелой узел ПС с длиной ресничек. В гораздо раньше или позже эмбрионов (например, 12 h до или после) узел может присутствовать не на поверхности. WMIF в этом отношении является немного более гибким, но сами структуры также являются временными во время разработки и сроков в этом случае зависит от интересов исследователей.
Чистота реагентов также имеет важное значение для успеха этих методов, особенно в зондирующего Ультраструктура по SEM. Tiny примесей, которые приклеиваются к эмбрионов обычно приводят к огромные артефактов.
Мы протестировали два различных методов фиксации эмбриона для SEM одно используя половину Карновского фиксатором (2,5% глютаральдегид, буфера cacodylate 2% параформальдегида и 0,1 М) и проще глютаральдегид 2,5% в однократном ПБС. Мы предпочитаем использовать в низкотемпературном растворе глютаральдегида и PBS фиксатор, как описано в шаге 1, однако, мы и другие также половину Карновского фиксатором успешно используется для SEM.
Мы также по сравнению двух методов сушки эмбрионы для SEM и нашли никакой разницы в качестве образца с помощью либо критической точки сушилка HMDS как описано в шаге 1 и других сообщили14.
Шаг 2, мы проверили встраивание эмбрионов после окончательной стирки шаги в низких плавления агарозы 1% монтажа на 35 мм стекло дно блюдо и затем долива он с ~ 10 мкл монтажа среды. Этот метод внедрения работает и сохраняет оригинальный 3D структура эмбриона и связанные с ними структуры; Однако, микроскопом multiphoton требуется изображение образца, потому что регулярные Конфокальный микроскоп не может достичь так глубоко в неповрежденной эмбрионов (~ 1 мм).
Мы считаем, что использование этих двух методов дает дополнительную информацию о структуре узла и notochordal плиты во время нормального развития и мутантов, которые показывают дефекты в формировании этих структур.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
H.B. поддерживается запуск финансирование медицинского факультета и SFB829 Кёльнского университета. C.X. поддерживается DFG Грант Ба 5810/1-1. Мы хотели бы поблагодарить визуализации объектов на CECAD научно-исследовательский центр и Мемориал Слоун Kettering Рак центр (Нью-Йорк, США). Мы благодарим Хоакин Грего-Бесса (Испанский Национальный центр сердечно-сосудистых исследований, Мадрид, Испания) за его представление на монтаж эмбрионы для WMIF.
Materials
| 1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
| Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
| Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
| SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
| SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |
Referências
- Rivera-Pérez, J. A., Hadjantonakis, A. K. The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).
- Lee, J. D., Anderson, K. V. Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse. Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).
- Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions. Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).
- Yoshiba, S., et al. Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2. Science. , (2012).
- Jurand, A. Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).
- Poelmann, R. E. The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo. Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).
- Sulik, K., et al. Morphogenesis of the murine node and notochordal plate. Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).
- Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).
- Bazzi, H., Anderson, K. V. Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).
- Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- McMullan, D. Scanning electron microscopy 1928-1965. Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).
- Bai, S. W., et al. Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration. BMC Biology. 9, (2011).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition. Cold Harb Lab Press. , (2014).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186, 84-87 (1997).
