ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

動物実験を含むすべての実験は、北ライン ヴェストファーレン (NRW-LANUV) に責任がある権限によって承認されました。 1. マウス胚ノードの電子顕微鏡 妊娠中の雌マウスを犠牲 ~ 頚部転位によって E7.5 (2-4 体節期)。手順 1.1 – の図と詳細な説明 1.7 マウス胚研究室マニュアル13で利用可能です。 皮膚と mesenteries を介して腹部を開け、はさみおよび微細鉗子を使用して子宮を取り外します。 蒸留水で簡単に子宮をすすぎ、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 を含む小さなきれいなペトリ皿 (6 cm) に置きます。 解剖顕微鏡、微細鉗子を使用して、[には、無料個別 deciduae または着床する子宮の筋肉を削除します。 1 組の鉗子で各脱落膜を押し、他のペアを使用して、赤い部分 (将来胎盤) と白い部分 (胚が配置されて) の間縦全層切開を行います。脱落膜の白い部分に沿って垂直方向に表面の穿孔は切開と連続してください。脱落膜を 2 つの半分に水平方向に離れて引っ張るし、慎重に両名の白い部分で胎児をかき出します。 新鮮な無菌ろ過 PBS で新しいペトリ皿 (35 mm) に胚を転送します。すべての deciduae/胚に対して繰り返します。 ライヘルトの膜を削除、胚を巻き込む比較的不透明な膜、いじめによってそれぞれの胚からそれまで好きで胎盤円錐 (赤味がかった注入サイト) から始まる靴下。ジェノタイピング、小さな作品を取る (〜 0.1 mm2) この段階での卵黄嚢の。 化学フードと適切な保護 (手袋) を着て、室温で遠心 (1.5 mL) チューブ フィルター滅菌 PBS で 2.5% グルタルアルデヒドで構成される EM グレード定着剤に胚を転送します。4 ° C で一晩胚を修正します。 慎重にチューブから胚を触れることがなくグルタルアルデヒド固定液を削除し、適切な廃棄容器に捨てます。胚を 3 回洗浄滅菌フィルターの pbs は、室温で 15 分間。 5 分間エタノール シリーズで胚を脱水: 50%、70%、85%、100% または無水エタノールで 3 回。エタノールに − 20 ° C で胚を格納したり、次のステップに進みます。 臨界点の臨界点乾燥機 (CPD) を乾燥のためのバスケットにエタノールで胚を転送します。バスケットを完全にカバーするエタノールで部屋を埋めます。 慎重に 10 ° C で 10 倍の液体 CO2でフラッシュすることにより、エタノールを交換します。商工会議所が半分になるまで、最後のステップ後液体 CO2を切る。40 ° C を熱圧力 80 バー (臨界点) に達すると、液体 CO2ガスに変わるまで。10 分間待ってから、ゆっくりと約 45 分以上のガスを吹き飛ばします。 乾燥の CPD に簡単に代わりに、30 分のためのエタノールの胚を 1:1 の比率でヘキサメチルジシラザン (HMDS) を追加します。30 分削除の純粋な HMD にピペットを使用して液体のうち胚の胚を転送し、30 分間乾燥するままにします。注: 両方の乾燥方法は均等に働いても私たちの手で。 両面テープの SEM スタブを乾燥胚腹側 (ノード) でマウントするのに細かいブラシを使用します。 長く細い繊毛を充電するため好まれる金粒子コーティング スパッタ コーティング マシンに胚とスタブを挿入します。120-150 の層を適用する Å;時間は各サンプルに異なります電流に依存しています。 SEM 顕微鏡に胚とコーティングされたスタブを配置、真空を適用し、萌芽期ノードと倍率 1000 倍から 15 に至るまでに繊毛を持つ脊索細胞観察 000 X。 2. 全体のマウント蛍光マウス ノードと脊索板の 0.05% で氷冷 PBS を使用してトゥイーン 20 (PBSTw) は、E7.75 で胚を削除し、PBSTw で 35 mm シャーレ氷の上に置いて 1.1 1.7 上記手順に従います。 化学のフードと適切な保護 (手袋) を着て、下の微量遠心チューブに PBS で 4% パラホルムアルデヒド固定液に胚を転送します。4 ° C で一晩胚を修正します。 慎重にチューブから胚を触れることがなくパラホルムアルデヒド固定液を削除し、適切な廃棄容器に捨てます。0.2% を含む PBS で胚を 3 回洗浄トリトン X-100 (PBSTr) 室温で 5 分間。ならびにシェーカーにすべての洗浄およびインキュベーション、次の手順を実行します。 最後の洗浄を削除し、(二次抗体のホスト種) から 10% 熱非動化血清ブロッキング溶液 PBSTr を追加します。2 h からブロックに一晩 (以上) の 4 ° C で nutator ブロックを削除し、追加 〜 1 mL ソリューション 1: 500 希釈でたとえば抗体抗 T ブロックで希釈した一次抗体の。4 ° C で nutator の一夜 (またはそれ以上) を孵化させなさい 一次抗体を削除し、0.02% (20% 株式抗体溶液の 1 mL を 1 μ L) の最終的な集中にアジ化ナトリウムを追加して後で使用のために保存します。抗体は再利用できる ~ 10 回。PBSTr で 2 回胚を洗い、4 ° C で nutator に各 30 分の 3 回洗い、そして 洗浄を置き換えますで希釈した一次抗体のホスト種に対して、蛍光標識二次抗体 ~ 1: 1000 オーバー ナイト (以上) 4 ° C で nutator に 二次抗体を削除し、PBSTr、そして PBSTr で 30 分間、3 回洗浄で二回リンスします。 最後の洗浄を室温で 1 時間の核を染色する F-アクチンと 1: 1000、DAPI 染色する 1: 500 蛍光標識ファロイジンを含む PBSTr に置き換えます。 PBSTr で二度洗い、室温で 30 分間 PBSTr で 1 回洗浄します。 PBS の PBSTr を交換し、氷に胚を残します。水グリセリン ベース土台メディア、たとえば、1xPBS で 90% のグリセロール、胚をマウントするための antifade 試薬と coverslips (24 × 24 mm) きれいな正荷電のスライド (60 × 24 mm) を準備します。 距離で明確なテープの 2 つの部分を入れて 〜 15 mm スライドの明確な部分でお互いから。これは、胚を平坦化、それらを完全につぶしになります (Z 軸) の十分の 3 D 空間が作成されます。 解剖顕微鏡の下で慎重にスライドする (転送して破損していない胎児に十分なスペースを許可する) にカット P200 ピペットを用いた胚に移動します。 微細鉗子を使用して、胚を展開する卵黄嚢の横側に 2 つの完全カットを作る。(スライド上を神経管の背側)を腹側 (ノードと脊索板) を持つ胚を配置します。 胚にメディアをマウントの 50 μ L を追加します。スライドあたり 4-5 胚を配置します。まずタッチ スライド (上部または下部側)、テープの 2 つの部分をまたぐ配置し空気泡を作成を回避しながら微細鉗子または曲がった細い針を用いた胚の上にゆっくりと下ろします、coverslip の側にメディアのマウントを塗りを追加します。 吸収のワイプを使用して余分なマウント メディアをクリーニングします。プロセスで、coverslip を移動しないように注意してください。 マニキュアの寛大な量を使用して、それを移動することがなく、coverslip の側面をシールします。 走査型共焦点顕微鏡の下で観察します。