用扫描电镜和全贴免疫荧光技术可视化小鼠胚胎中的节点和外型板

所有涉及动物实验的实验都得到了北莱茵威斯特伐利亚 (lanuv-nrw) 主管当局的批准。 1. 小鼠胚胎结节的扫描电子显微镜 在 ~ e7.5 (2-4 至4体细胞期) 通过宫颈脱位产下, 为怀孕的雌性小鼠做出牺牲。小鼠胚胎实验室手册13中提供了带有步骤 1.1-1.7 图表的详细说明。 通过皮肤和肠系膜打开腹部, 用剪刀和细钳切除子宫。 用蒸馏水将子宫短暂冲洗, 并将其放入含有1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 的清洁培养皿 (6 厘米) 中。 在解剖显微镜下, 使用精细的钳子, 取出子宫肌肉, 以释放个别的脱落或植入部位。 用一对钳子固定每个脚折器, 并使用另一对在红色部分 (未来胎盘) 和白色部分 (胚胎所在的地方) 之间进行纵向全厚度切口。沿决定的白色部分垂直进行浅表穿孔, 与切口相邻。将决策头水平地分开成两半, 并小心地挖出决策条白色部分中的胚胎。 用新鲜的消毒 pbs 将胚胎移植到新的培养皿 (35 毫米)。对所有脱落的胚胎重复上述步骤。 从每个胚胎中取出 reichert 的膜, 这是一个相对不透明的膜, 吞没胚胎, 它像从胎盘锥 (带红色植入部位) 开始的袜子一样将其游走。对于基因分型, 在这个阶段取一个小片 (~ 0.1 毫米2) 的蛋黄囊。 在化学罩下, 佩戴适当的保护 (手套), 在室温下, 将胚胎转移到由2.5% 戊二醛组成的 em 级固定剂, 在室温下, 在经过消毒过滤的 pbs 中, 将胚胎转移到 em 级固定剂中。在4°c 下将胚胎隔夜修复。 小心地从试管中取出戊二醛固定剂, 而不接触胚胎, 并丢弃在适当的废物容器中。在经过消毒滤过的 pbs 中清洗胚胎三次, 在室温下每次15分钟。 在乙醇系列中使胚胎脱水 5分钟: 50%、70%、85%, 100% 或绝对乙醇3次。将胚胎储存在-20°c 的乙醇中, 或直接进入下一步。 将乙醇中的胚胎转移到篮子中, 以便在临界点干燥机中进行临界点干燥 (cpd)。在房间里装满乙醇, 使篮子完全覆盖。 在10°c 下, 用液体 co2 仔细冲洗 10次, 将乙醇交换。在最后一步后排出液体co2 , 直到腔内半满。加热至 40°c, 直到压力达到80巴 (临界点), 液体co2变为气体。等待 10分钟, 然后慢慢吹掉气体约45分钟。 作为干燥 cpd 的一种更容易替代的方法, 在乙醇中的胚胎中加入1:1 的六甲基二硅烷 (hmds) 30分钟。然后将胚胎转移到纯 hmds 30分钟内, 用移液器将胚胎从液体中取出, 使其干燥30分钟。注: 两种干燥方法在我们手中同样有效。 使用精细的刷子将干燥的胚胎安装在双面胶带的 sem 存根上。 将螺柱与胚胎插入用于金颗粒涂层的溅射涂布机中, 该涂布可用于为细长的纤毛充电。应用一层 120-150;时间取决于电流, 这将因每个样本而异。 将涂覆的螺柱与胚胎一起放入 sem 显微镜中, 应用真空观察胚胎节和具有纤毛的贵族板细胞, 放大倍率从1000x 到 15, 000x 不等。 2. 小鼠结点和外型板的全贴免疫荧光 使用冰凉 pbs 与 0.05% tween 20 (pbstw), 按照上面的步骤 1.1-1.7 去除在 e7.75 的胚胎, 并将它们放在 pbstw 在一个35毫米 petri 菜在冰上。 在化学罩下, 佩戴适当的保护 (手套), 将胚胎转移到微离心管中 pbs 中4% 的甲醛的固定溶液中。在4°c 下将胚胎隔夜修复。 小心地从试管中取出甲醛固定剂, 而不接触胚胎, 并丢弃在适当的废物容器中。在含有 0.2% triton x-100 (pbstr) 的 pbs 中每次在室温下清洗胚胎 3次5分钟。在一个疯狂的振荡器上执行所有的清洗和下一个孵化步骤。 取出最后一次洗涤, 并添加含有 pbstr 的阻滞液与10% 的热灭活血清 (从二级抗体的宿主物种)。在4°c 下, 用坚果从2小时阻挡到过夜 (或更长时间)。 去除阻塞性抗体的阻塞, 并在阻断溶液中添加 ~ 1 毫升, 例如在1:500 稀释时的抗 t 抗体。在4°c 下用坚果隔夜 (或更长时间) 孵化。 将原发抗体取出, 保存后使用, 方法是将氮化钠添加到0.02% 的最终浓度 (20% 的库存为1毫升的抗体溶液中的 1μl) 中。该抗体可重复使用 ~ 10次。用 pbstr 将胚胎冲洗两次, 然后在4°c 时用坚果每次清洗三次, 每次30分钟。 将洗涤替换为荧光共轭二级抗体, 针对主要抗体宿主物种, 在大约1:1000 夜间 (或更长时间) 在4°c 时在坚果上稀释。 取出二级抗体, 用 pbstr 冲洗两次, 然后用 pbstr 冲洗三次, 时间为30分钟。 将最后一次清洗改为含有 1: 500 荧光共轭吡华定的 pbstr, 以染色 f-actin 和 1:500 dapi, 在室温下染色核1小时。 在 pbstr 中冲洗两次, 在室温下用 pbstr 清洗一次, 时间为30分钟。 用 pbs 取代 pbstr, 并将胚胎留在冰上。准备干净的正电荷幻灯片 (60 x 24 毫米) 和盖板 (24 x 24 毫米) 和水甘油为基础的安装介质, 例如, 在1xpbs 中的90% 甘油和抗褪色试剂, 以安装胚胎。 将两片透明胶带放在幻灯片的透明部分, 距离彼此约15毫米。这将创建足够的3d 空间 (在 z 维度中), 允许扁平的胚胎, 但不会完全压扁它们。 在解剖显微镜下, 使用切割的 p200 移液器将胚胎小心地移动到滑梯上 (以便为胚胎转移而不损坏足够的空间)。 使用精细的钳子, 在卵黄囊的侧侧进行两次全切, 以展开胚胎。将胚胎与腹侧 (节和脊索板) 向上 (神经管的背侧向下滑动) . 在胚胎上加入50μl 的安装介质。每张幻灯片放置4-5 个胚胎。在盖板的一侧添加一个安装介质, 首先接触滑梯 (顶部或底部), 然后将其跨跨两片胶带, 用细钳或弯曲的细针将其慢慢降低到胚胎上, 同时避免产生气泡。 使用吸水擦拭清洁多余的安装介质。请注意, 不要在过程中移动盖板。 使用大量的指甲油, 在不移动的情况下密封盖板的两侧。 在扫描共聚焦显微镜下观察。