여기, 우리는 성인 zebrafish의 자연 병원 체 진 균 marinum를 사용 하 여에 프로토콜 모델 인간의 결핵을 제시. 추출 된 DNA와 RNA 감염 된 zebrafish의 내부 장기에서 총 mycobacterial를 물고기와 정량으로 호스트의 면역 반응에 로드 공개를 사용할 수 있습니다.
결핵균 은 현재 매년 1.7 백만 사망자와 10.4 백만 감염을 일으키는 최악의 인간 병원 체입니다. 이 박테리아에 노출 인간 멸 균된 감염에서 적극적으로 진행 하는 치명적인 질환에 이르기까지 다양 한 질병 스펙트럼을 발생 합니다. 가장 일반적인 형식은 잠재성 결핵, 무 증상, 하지만 가능성이 fulminant 질병으로 다시 활성화 합니다. 성인 제 브라와 그것의 자연 병원 체 진 균 marinum 최근 결핵의 질병 넓은 스펙트럼을 공부 하는 해당 모델을 입증 했다. 중요 한 것은, mycobacterial 감염의 맥락에서 적응 면역 반응 뿐만 아니라 자발적인 대기 시간 및 재가이 모델에서 공부 될 수 있다. 이 문서에서는, 우리는 성인 zebrafish, mycobacterial 로드 및 양이 많은 PCR에 의해 호스트 면역 응답의 측정에 대 한 핵 산 추출에 대 한 내부 장기의 컬렉션의 실험적인 감염에 대 한 방법을 설명합니다. -집을-개발한, M. marinum-특정 정량 분석 결과 또한 비 분할 휴면 또는 최근에 죽은 mycobacteria에서 DNA 탐지 전통적인 도금 방법 보다 더 민감한. 로 동일한 개인에서 DNA와 RNA 추출, 질병 상태, 그리고 호스트와 병원 체 유전자 발현의 관계를 연구 가능 하다. 결핵에 대 한 성인 zebrafish 모델은 따라서 호스트 병원 체 상호 작용 연구에 매우 적용, 비 포유류에서 vivo에서 시스템으로 자체을 선물 한다.
Zebrafish (Danio rerio) 생물 의학 연구에 널리 사용 되는 동물 모델 이며 일반적인 척 추가 있는 생물학에 대 한 허용된 모델입니다. Zebrafish는 인간의 질병을 모델링 연구의 많은 분야에 맞게 조정 되었습니다 및 감염 및 면역학 연구의 여러 세균 3 및 바이러스 감염4 1 암 심장 질환2 에서 장애 , 5. 또한, zebrafish 태아의 전 utero 개발 했다는 제 브라 인기 모델 개발 생물학6 및 독물학7,8.
감염 생물학을 포함 하 여, 연구의 많은 분야에서 광학 투명 zebrafish 애벌레는 일반적으로 사용 됩니다. 원시 세포는 검색 된9때 첫 번째 면역 세포 24 h 게시물 수정 (hpf)에 표시 됩니다. 호 중구는 약 33 hpf10표시 다음 면역 세포 이다. Zebrafish 애벌레는 이렇게 감염의 초기 단계 적응 면역 세포11의 부재에서 타고 난 면제의 역할을 연구 하 고 실현. 그러나, 그것의 완전 한 기능 적응 면역 시스템과 성인 zebrafish 감염 실험에 대 한 복잡성의 추가 계층을 제공합니다. T 세포 감지할 수 있습니다 주위 3 일 게시물 수정12및 B 세포는 기능 항 체를 생산할 수 4 주 게시물 수정13. 성인 zebrafish 포유류 타고 난 및 적응형 면역 시스템의 모든 주요 대응 하고있다. 물고기의 immune systems와 인간 사이의 주요 차이점은 림프 조직의 해부학에서 뿐만 아니라 항 체 isotypes에서 발견 된다. Zebrafish는 반해 인간이 515세 항 체 클래스14, 있다. 골 수와 림프절의 부재, 물고기에서 기본 림프 장기는 신장과 thymus16 와 비장, 신장과 창 자 2 차 림프 기관17역할. 타고 난 및 적응형 셀의 전체 면역 무기고와 이러한 차이도 불구 하 고 성인 zebrafish 호스트 병원 체 상호 작용 연구에 대 한 높은 적용, 사용 하기 쉬운, 비 포유류 모델입니다.
Zebrafish는 요즘 결핵18,,1920,,2122공부 가능한 모델로 설립 되었습니다. 결핵은 결핵균에 의해 발생 하는 공 수 질병 이다. 세계 보건 기구에 따르면 결핵 2016 년에1.7 백만 죽음을 야기 하 고 하나의 병원 체 전세계23에 의해 죽음의 주요 원인이 다. 마우스24,25, 토끼26 및 비 인간 영장류27 가장 유명한 동물 모델 각 얼굴 하지만 결핵 연구에 그들의 한계는. M. 결핵 감염의 비 인간 영장류 모델 유사 인간의 질병 가장 밀접 하 게, 하지만이 모델을 사용 하 여 하는 것은 심각한 윤리적 고려 사항으로 인해 제한 합니다. 다른 동물 모델 M. 결핵 질병 병 리에 영향을 주는 호스트 특이성에 의해 방해 된다. 아마 결핵 모델링에서 가장 큰 문제는 인간의 질병에 감염 및 질병 결과의 광범위 한 스펙트럼: 결핵은 매우 이질적인 질병 면역 잠재성, 활성 및 다시 활성화 감염28 살 균에서 배열 을 재현 하 고 실험적으로 모델 하기 어려울 수 있습니다.
진 균 marinum 85% 아미노산 신원을29와 ~ 3000 orthologous 단백질 M. 결핵 의 가까운 친척 이다. M. marinum 는 자연스럽 게 zebrafish 생산 육아, 그것의 내부 장기19,30에서 결핵의 감염. 결핵 연구에 사용 되는 다른 동물 모델, 달리 zebrafish 생산 많은 자손, 그것은 제한 된 공간을 요구 한다 그리고 중요 한 것은, 그것은 neurophysiologically 최소한 개발된 척추 결핵 모델 사용할 수 있습니다. 또한, M. marinum 감염 원인 잠재성 감염, 활성 질병 이나 심지어 살 균 mycobacterial 감염의 성인 zebrafish 밀접 하 게 인간의 결핵19, 의 결과의 스펙트럼을 흉내 낸 31 , 32. 여기, M. marinum 복 부 캐비티에 주입 하 고 양이 많은 PCR를 사용 하 여 mycobacterial 부하와 제 브라에서 면역 반응을 측정 하 여 실험 결핵 모델 성인 zebrafish의 방법 설명 조직 샘플입니다.
여기는 실험적으로 감염 된 성인 zebrafish 조직에서 추출한 DNA에서 mycobacterial 로드를 측정 하는 정량 기반 응용 프로그램에 설명 합니다. 이 응용 프로그램은 뇌관 16S 23S rRNA 내부 베낀된 공백 시퀀스40설계를 기반으로 합니다. 생선 샘플에서 총 mycobacterial 부하 DNA 교양된 mycobacteria의 알려진된 수에서 추출 하 고 어떤 주어진된 순간에 그 한 박테리아는 그것의 게놈의 복사본이 하나…
The authors have nothing to disclose.
이 작품으로는 핀란드 문화 재단 (H.L.), 템 퍼 결핵 재단 (H.L., L. M.V. M.M.H., M.P.), 핀란드 결핵 협회 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., 재단 지원 되었습니다. M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius 재단 (M.P.), 에밀 Aaltonen 재단 (M.M.H.), 제인 및 Aatos Erkko 재단 (M.P.)와 핀란드의 아카데미 (M.P.). Leena Mäkinen, 한 나-Leena Piippo 및 제 나 Ilomäki에 그들의 기술 지원을 인정 됩니다. 저자는 그들의 서비스에 대 한 템 퍼 Zebrafish 실험실을 인정합니다.
Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
Chloroform | VWR | 22711.290 | |
Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
Sonicator m08 | Finnsonic | ||
Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |