דור של תאים אנושיים כמו תא הנבט הקדמונים על פני השטח של גופים Embryoid מן pluripotency בשלה המושרה בתאי גזע Pluripotent
Summary
בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) הם מבשרי נפוצות של זרע וגם ביצים. PGCs עובריים אנושיים מצוינים מתאי epiblast pluripotent באמצעות אינטראקציות של ציטוקינים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול 13 יום של גרימת transcriptomally תאים אנושיים הדומה PGCs על פני השטח של גופים embryoid מתאי גזע pluripotent טענתי-pluripotency המושרה.
Abstract
בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) הם מבשרי משותף של כל התאים germline. ב העכבר עוברי, אוכלוסיה המייסד של PGCs ~ 40 הן תוצאה של תאים pluripotent epiblast חשיפות מתוזמר ציטוקינים, כולל עצם חלבון morphogenetic 4 (Bmp4). עוברי אדם, PGCs המוקדם זוהו על הקיר endodermal של שק החלמון סביב סוף השבוע 3rd של ההיריון, אך מעט ידוע על התהליך של מפרט PGC האנושי ופיתוח המוקדמות שלהם. כדי לעקוף את המחסומים טכנית ואתיות של הלומדים PGCs עובריים אנושיים, הפונדקאית תא תרבות מודלים נוצרו לאחרונה מתאי גזע pluripotent. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול 13 יום לייצור חזקים של תאים אנושיים PGC-Like (hPGCLCs). האדם המושרה גזע pluripotent (hiPSCs) בהשתתפות המדינה pluripotency להתקפת מודגרות ב נאיבי 4i התכנות בינונית למשך 48 שעות, חלופה מועדפת על תאים בודדים, הארוזים לתוך microwells. תחזוקה ממושך של hiPSCs במדינת pluripotency תמים גורם משמעותי סטיות כרומוזומליות, יש להימנע. hiPSCs, microwells נשמרים במשך 24 שעות ביממה, המדיום 4i לגופים טופס embryoid (EBs), אשר לאחר מכן נוספים תרבותי ב נמוך-הדבקות plasticware בתנאי נדנדה במדיום אינדוקציה hPGCLC המכיל ריכוז גבוה של BMP4 האנושי רקומביננטי. EBs עוד יותר מתורבתים עד 8 ימים מצב נדנדה שאינם מחסידי כדי להשיג תפוקה מקסימלית של hPGCLCs. מאת אימונוהיסטוכימיה, hPGCLCs ברצון מזוהים כתאים חזק לבטא OCT4 ב כמעט כל EBs באופן בלעדי על פני השטח שלהם. כאשר EBs enzymatically הפומבית, נתון FACS העשרה, hPGCLCs ניתן לאסוף כתאים CD38 + עם עד 40-45% תשואה.
Introduction
בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) הם מבשרי משותף של כל התאים germline משני המינים. רוב הידע שלנו לפיתוח של PGCs עוברי יונקים התקבל דרך לימוד מעבדה-עכברים-1,–2. -עובריים יום 6.0-6.5 של העכבר עוברי, 6 או דומה מספר קטן של סימנים מקדימים PGC ממוקמים על epiblast, אוכלוסיה המייסדות של ~ 40 ש-pgcs הם המושרה מהם באופן תלוי עצם חלבונים morphogenetic Bmp2 ו- Bmp4 המופרשים סמוכים תאים. PGCs האנושית המוקדמת ביותר שתוארה עד כה העוברים היו על הקיר endodermal של שק חלמון-בסוף השבוע השלישי של ההיריון3. כי זה באותו המקום כמו PGCs נודדים הם נצפו העכבר עוברי, סביר להניח כי PGCs האנושית שנצפו היו בדרך של העברה אבל לא האוכלוסייה המייסדים. עם זאת, מחקרים מעקב לחזור לשלבים מוקדמים יותר של PGCs או PGC סימנים מקדימים ב עוברי אדם היו חסרים.
גישה PGCs עובריים אנושיים הוא מאתגר עקב מכשולים טכניים וגם מוסרית. כדי להתגבר על מכשולים אלה, מודלים תרבות PGC דמוי תא נוצרו לאחרונה מתאי גזע pluripotent אנושי (מגירסה). Pluripotency הוא היכולת הסלולר להבדיל לתוך germline שלוש שכבות הנבט עובריים4. ואילו מגירסה אנושי בהשתתפות המדיום mTeSR1 (מוכן לשימוש, זמינים מסחרית מדיום ניסח עבור תחזוקת מגירסה האנושי במדינה pluripotency להתקפת) על מנות מצופה עם החלבון מטריצה חוץ-תאית יש מצבים בשלה pluripotency 4, ב- 2013 המעבדה של יעקב חנה הראו כי ניתן להמיר את התאים pluripotency להתקפת מדינה pluripotency תמימה מאת לחשוף את המדיום תאי גזע אנושי תמים (NHSM) המכיל מעכבי כימי כדי חלבונים kinases ERK1/2, GSK3, JNK, רוק, PKC, p38 MAPK וכן גורמי גדילה LIF, TGF, bFGF5. החל מגירסה האנושי תמימה-pluripotency, בשנת 2015 הושלמה קבוצת מחקר בראשות חנה Surani עזים חזקים בהפקה הראשונה של התאים PGC-Like האדם (hPGCLCs) מגירסה6. מאוחר יותר, מספר מעבדות אחרות, כולל שלנו, דיווח דור של hPGCLCs החל מגירסה באמצעות פרוטוקולים שונה במקצת7,8,9,10. המחקר שלנו מספק ראיות כי hPGCLCs שנוצר באמצעות פרוטוקולים שונים (אשר מסוכמות בטבלה S1 של מחקר שפורסם בעבר שלנו10) הם דומים אחד לשני10transcriptomally. הראיות הזמינות תומך את הדמיון של האדם PGCLCs כדי PGCs עובריים אנושיים בשלב מוקדם לפני המחיקה epigenetic הכללית7 ו/או העברה chemotactic10.
מחקרים של העכבר PGCs עובריים בעכבר PGCLCs, PGCLCs האנושית (אבל עם רק גישה מוגבלת מאוד PGCs האנושי) חשפו המנגנונים המולקולריים של מפרט PGC נבדלים באופן משמעותי בין העכבר האנושי1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. לדוגמה, Prdm14 משחק תפקידים חיוניים במפרט PGC ב העכבר עוברי, אבל תפקידה במפרט PGC האנושי נראה מוגבל1,15. לעומת זאת, אינדוקציה של SOX17 על ידי EOMESODERMIN הוא חיוני עבור PGC מפרט6,11,14, ואילו אלה גורמי שעתוק נראה לוותר על העכבר PGC מפרט15. הישגים אלו הראשונית של מחקרים באמצעות hPGCLCs חריפה לתמוך את החשיבות של המודל התרבות התא בתור פונדקאית של PGCs עובריים אנושיים.
מחקרים שפורסמו לאחרונה, שכללו הערכה של המעבדה שלנו רצף עמוק של ה-DNA עותק מספר אנליזה גנומית, הראו כי תחזוקה ממושך של מגירסה המדינה pluripotency תמים מגביר באופן משמעותי את הסיכון של אי יציבות כרומוזומלית, חריגות מבנית. התופעה נצפתה עם העכבר18 וגם אנושי19 מגירסה. הפרוטוקול המקורי hPGCLC ייצור שדווחו על-ידי חנה/Surani פותחה עבור האדם מגירסה בהשתתפות המדיום pluripotency תמים 4i לפחות 2 שבועות6. כדי לשמר קריוטיפ דיפלואידי נורמלית של האדם מגירסה ושל PGCLCs, פיתחנו פרוטוקול שונה שבו האדם מגירסה נחשפים המדיום 4i רק 72 שעות10, אשר מוצג במאמר זה. אדם iPSCs (hiPSCs) מתוחזקים תחת המדינה כאשר הבחינה pluripotency. מיד לפני היווצרות EB, תאים מודגרת במדיום 4i תמים התיכנות (מדיום NHSM ששונה) למשך 48 שעות. תאים ואז הפומבית, דחוסים microwells לטופס EBs 24 שעות נוספות במדיום 4i. EBs מתוחזקים במדיום אינדוקציה hPGCLC המכיל ריכוז גבוה של BMP4 האנושי רקומביננטי בתנאי נדנדה לתרבות לא-מצורף עד 8 ימים כדי לקבל את התשואה המרבי של hPGCLCs. לאחר 8 ימים EB תרבות, hPGCLCs יכול להיות מבודד מתאי EB חלופה מועדפת על ידי FACS כפי CD38 + תאים עם ~ 40% תשואה FACS שאינה ניתנת למיון ההשעיה תא בודד. ואילו השני לאור שיטות7,8,9, כולל הפרוטוקול המקורי לפני השינויים6, בדרך כלל מחוללים hPGCLCs ב אגרגטים התא בנוי באופן ספונטני ללא ספציפי לוקליזציה, hPGCLC המיוצר על ידי פרוטוקול שלנו הם נצפו על פני השטח של גופים embryoid (EBs).
Protocol
Representative Results
Discussion
ייצור איתנה של hPGCLCs באמצעות פרוטוקול המתואר כאן אושר עם שלושה עצמאית שכפולים של האדם iPSCs עם קריוטיפ דיפלואידי נורמלית10. אלה שיבוטים iPSC היו נגזר באותו עור עורי neonatal פיברובלסט תא תרבות10. הם יסופקו על ידי מחברי מאמר זה לחוקרים על פי בקשה, תחת הסכם העברת חומרים המתאימים ומשלוח סידור תאים אנושיים חיים קפואים. לא ידוע כרגע אם קריוטיפ נורמלי היא הדרושים לייצור hPGCLC חזקים באמצעות פרוטוקול שלנו או לאלה שדווחו על ידי מעבדות אחרות.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הייצור של hPGCLCs hiPSCs11 או ESCs14 באמצעות פרוטוקול מתוארת על ידי הקבוצה של היא של אוניברסיטת קיוטו8 הוא תלוי הביטוי של EOMESODERMIN, גורם שעתוק T-box הדרושות אינדוקציה של SOX17. SOX17 נראה לתפקד כמו שושלת היוחסין בסיס לקביעת גורם שעתוק ב germline התמיינות של תאי גזע pluripotent האנושי6. EOMESODERMIN מקודד על ידי הגן EOMES , CRISPR/Cas9 נוקאאוט של EOMES גרמה העדר כמעט מוחלט של אינדוקציה SOX17 hPGCLC בהפקת תנאי11ואת הביטוי של גנים אחרים אחריו את אותה תבנית של תאים SOX17-null נוקאאוט. ביטוי של EOMESODERMIN של וקטור inducible ב EOMES-תאים נוקאאוט null במהלך hPGCLC אינדוקציה תרבות ביעילות הציל את הייצור hPGCLC חזקים, כמו גם אינדוקציה של גנים germline, כולל SOX17. לעומת זאת, ביטוי מושרה SOX17 גם הציל את הייצור PGCLC חזקים אך ללא גרימת EOMES. לפיכך, EOMESODERMIN משרן במעלה קריטית של SOX17, זה נראה התפקיד החשוב ביותר יחיד של EOMESODERMIN ב hPGCLC אינדוקציה מתאי גזע pluripotent אנושי. פרוטוקול שלנו גורם SOX17 hiPSCs10, אבל את התלות אינדוקציה EOMESODERMINE מחכה נקבע.
פרוטוקול זה ממיר pluripotency בשלה iPSCs אנושי בהשתתפות המדיום mTeSR1 כדי pluripotency תמים שאינו תלוי-טיפשה במשך 96 שעות ב- 4i התכנות בינונית6, אשר הוא תמים ששונה תאי הגזע האנושי בינוני (NHSM)5. הניסיונות שלנו לייצר hPGCLCs החל שיבוטים אנושיים iPSC אותו, אבל שמר על תקשורת צמיחה אחרים זמינים מסחרית iPSC האנושי לפני התרבות ב- 4i התכנות בינוני, גרמו בדרגות שונות של התשואות hPGCLC התחתון. אמנם אם הסתגלות וקהילותיהם מדיה אחרים משפרת את ייצור hPGCLC או לא נותר להיקבע במחקרים עתידיים, התבוננות זו עולה כי המצב המדויק של pluripotency כאשר הבחינה של האדם iPSCs לפני 4i התכנות באופן משמעותי משפיע EB-צורה המדיום 4i ובידול EB hPGCLC בינוני.
הייצור של hPGCLCs מ- hiPSCs ע פ הפרוטוקול שלנו הוא מאוד לשחזור, חלקית עקב השימוש של הלוחות microwell המאפשרים ייצור יעיל של מספר גדול של EBs ועמיד (~ 8,000 EBs לכל אצווה) בגודל אחיד (3,000 hiPSCs לכל EB). המספר של EBs ברצון מיוצר אצווה בודדת של הניסוי באמצעות פרוטוקול שלנו עשוי להיות גדול בהרבה שיטות שימוש הבארות רגיל של התרבות התא U-התחתון. ייצור של מספר גדול של לא פחות EBs בגודל אחיד משובץ hPGCLCs עשוי לספק הזדמנויות ייחודיות של הקרנות כימי תפוקה גבוהה כדי לזהות מפעילים קטן משקל מולקולרי או מעכבי המשפיעים על מפרט PGC או שלהם מאפיינים ביולוגיים כגון התכנות epigenetic. EBs כזה גם עשויה להיות שימושית עבור הערכות רעילות מספר גדול של תאים germline חשיפה לרעלים, כולל לא רק מזהמים סביבתיים אלא גם מבחינה רפואית מרשם תרופות כגון סוכני כימותרפיות.
הגורמים הקריטיים של ייצור לשחזור ועמיד hPGCLCs באמצעות פרוטוקול הציג כוללים (i) שימוש בריא hiPSCs בהשתתפות mTeSR1 על חלבונים מטריצה חוץ-תאית, (ii) לחסן את המספר המדויק של תאים כפי שצוין, בקפדנות בצע את התזמונים של שינוי בינונית ו תת-תרבות, (iii) כדי לבחור הרבה טוב BMP4 רקומביננטי האנושי, ו (iv) כדי למזער נזקים פיזיים של EBs במהלך התרבות נדנדה. . זה הניסיון שלנו שעבד הכי הרבה ריאגנט BMP4 ב 100 ננוגרם למ”ל ריכוז ואילו אחרים הרבה ריאגנטים BMP4 נדרש 2 X או במינון גדול יותר. לעומת זאת, התשואה של hPGCLCs הייצור באמצעות חלקו הטוב ביותר של BMP4 אלא ירידה במינונים גבוהים של BMP4 (למשל, 200 ng/mL). אנו ממליצים לבחון מגרשים שונים של recombinant ריאגנטים BMP4 האנושי המתקבל מספר ספקים עבור הביצועים שלהם בתמיכה hPGCLC הדור ועל מנת להבטיח כמות גדולה של הכי הרבה.
תכונה ייחודית של פרוטוקול hPGCLC שלנו היא כי hPGCLCs הם נקודתיים על שכבת פני השטח החיצוני של EBs10 (איור 8), בעוד פרוטוקולים אחרים ניתן להפיק hPGCLCs באמצע תא אגרגטים6,8. גופים embryoid נוטים ליצור שכבות נפרדות מרובות כגון פני השטח, המעטפת החיצונית, המעטפת הפנימית הליבה, ואת האזורים הליבה המרכזית הם לעתים קרובות עם נמק עקב היצע מוגבל של חומרים מזינים, חמצן, כמו גם טופס pro על הישרדות גורמי גדילה סיפק התרבות בינוני על ידי דיפוזיה20. לוקליזציה של hPGCLCs על פני השטח של EBs ללא מגבלות אפשריות בשל דיפוזיה מוגבלת לכיוון מרכז של EBs עשוי להיות מועיל עבור, זמן-מינון-מבוקר חשיפה ישירה של hPGCLCs סמים או חומרים רעילים עבור תרופתי או מחקרים רעילות.
ואילו העכבר PGCLCs הצג חזקים הגנום כולו DNA demethylation מעורבים החתמה לשלוט אזורים לפחות בחלקו7,19,20, מידת gDNA גלובל demethylation ב hPGCLCs נראה חלש יותר מאשר עכבר PGCLCS או PGCs6,7. פרופילים Transcriptomal מראים כי hPGCLCs אולי מזכירים את שלב מוקדם יותר PGCs עובריים מאשר עכבר PGCLCs10. בעבר דווח כי תרבות ממושך של EBs בתנאים של ייצור hPGCLC גרמה תואר מוגברת של gDNA demethylation7; עם זאת, אם תקופה ארוכה של התרבות של hPGCLCs ב EBs או תאים בודדים ניתן להשיג בשלבים מתקדמים יותר של בידול germline צריך להיקבע על ידי מחקרים עתידיים.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו להכיר Shiomi Yawata ו- Chie Owa לקבלת סיוע טכני במהלך מחקרים ראשוניים. מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIEHS/NIH R01 ES023316 ו- R21ES024861 ל TS, ועל ידי מענק דיילת רפואי מחקר מכון (FAMRI) JHH.
Materials
| Primed pluripotency hiPSC culture | |||
| Matrigel | Corning | 354277 | Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Store at 4 °C. |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance. |
| Y27632 | Axon | 1683 | Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C. |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | 07930 | Store at 4 °C. |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT104-500 | Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4i hiPSC culture | |||
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1286101 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I1882-100MG | Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C. |
| human LIF | PeproTech | 300-05 | Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C. |
| human FGF2 | R&D Systems | 4114-TC | Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| 4i basal medium | Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C. |
||
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C. |
| PD0325901 | Axon | 1408 | Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C. |
| BIRB796 | Axon | 1358 | Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| SP600125 | Tocris | 1496 | Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies | 27845 | Microwell plate |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hPGCLC culture | |||
| Glasgow’s MEM | Thermo Fisher Scientific | 11710035 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| hPGCLC basal medium | Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C. |
||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C. |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C. |
| Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C. |
| Human SCF | PeproTech | 300-07 | Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C. |
| Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C. |
| Cell strainer | Corning | 352340 | Pore size = 40 μm. |
| 50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352070 | |
| Low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermofisher | M79735Q | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemical staining | |||
| BLOXALL Blocking Solution | VECTOR | SP-6000 | |
| Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG |
VECTOR | MP-7405 | |
| OCT-3/4 Antibody | Santa Cruz | SC-8629 | |
| ImmPACT DAB | VECTOR | SK-4105 | |
| Permount | Thermofisher | SP15-100 | Mounting medium |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolating hPGCLC | |||
| Embryoid Body Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-348 | |
| Anti-CD38 antibody conjugated to APC | abcam | ab134399 |
Referências
- Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. How to make a primordial germ cell. Development. 141 (2), 245-252 (2014).
- Saitou, M., Yamaji, M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).
- De Felici, M. Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells. Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).
- Gafni, O., Weinberger, L., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).
- von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).
- Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).
- Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).
- Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).
- Kojima, Y., Sasaki, K., et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).
- Irie, N., Surani, M. A. Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).
- Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).
- Chen, D., Liu, W., et al. Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin. Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).
- Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146 (4), 519-532 (2011).
- Kobayashi, T., Zhang, H., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).
- Choi, J., Huebner, A. J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).
- Shirane, K., Kurimoto, K., et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).
