액 pluripotency에서 Embryoid 몸의 표면에 인간의 원시 생식 세포와 같은 세포의 생성 유도 만능 줄기 세포

1. 세포 배양 Primed Pluripotency 상태에서 hiPSCs의 세포 외 기질 단백질 코팅 접시의 준비 하룻밤 냉장고 또는 찬 룸에 얼음에 Matrigel (세포 외 기질 단백질)를 녹여 (실 온 또는 따뜻한 물 목욕을 사용 하 여 녹여 하지 않습니다). Aliquot 매트릭스 단백질 (~ 200 μ;는 약 수의 볼륨은 각 일괄 처리에 대 한 제조 업체에 의해 결정 하 고 유리병의 라벨에 표시 된) 살 균 낮은 바인딩 원심 분리기 관 또는 얼음에 셀 cryopreservation 튜브로. 그것은 세포 외 기질 단백질을 응고를 피하기 위해 분배 하는 동안 차가운 유지 하는 것이 중요입니다. -80 ° c.에 aliquots 저장 세포 외 기질 단백질으로 세포 문화 플라스틱 접시, 코트 25 mL로 한 약 수를 희석 차가운 DMEM/F12 및 3-10cm 요리 확산 (~ 8 mL/접시). 적어도 1 시간 동안 실 온에서 요리를 품 어. 코팅, 후 요리 Parafilm 사용 하 고 1 주까지 동안 실내 온도에 저장 밀봉 될 수 있다. 접종 액된 pluripotency hiPSCs의 바로 앞에서 중간 발음 매체 또는 인산 염 버퍼 칼슘/마그네슘-무료 식 염 수 [PBS(-)] 코팅 설거지 필요는 없습니다. HiPSC 문화 끝났다 pluripotency 상태에서 개시 15 mL 원심 분리기 튜브에 mTeSR1 매체의 10 mL를 2 µ L 50 mM Y27632의 [억제제로 관련 단백질 키 니 아 제 (바위)]를 추가 합니다. 고정 셀 주식 1 mL에서 한 10 cm 접시에 세포 배양을 시작 하 록 10 mL 억제제 보충 매체의 2 개의 관을 준비 합니다. Y27632 보충 매체를 사용 하 여 같은 날에. 5 분 동안 37 ° C 물 욕조에 prewarm Y27632 보충 매체.참고:이 프로토콜은 hiPSCs mTeSR1에 유지 잘 작동 합니다. HiPSCs는 변화와 인간의 PSC 성장을 지 원하는 다른 미디어에서 유지 될 때의 액 또는 순진한 pluripotency, hPGCLCs의 수확량 크게 다를 수 있습니다.참고: 완전 한 mTeSR1의 수명 4 ° C에서 2 주 및 6 개월 동안-20 ° C, 하지만 다시 냉동 성능 저하 원인입니다. 우리는 사용까지 40 mL aliquots-20 ° C에서 mTeSR1의 동결. 끝났다 pluripotency hiPSC 주식 (1 mL cryopreservation 매체에 106 셀 x 1.0-3.0) 냉동의 유리병을 녹여 37 ° C 물 목욕을 사용 하 여. 해빙의 완료 후 즉시 prewarmed Y27632 보충 매체의 한 튜브 (10 mL)에 유리병의 전체 콘텐츠를 전송할. 실내 온도, 300 x g에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 8 분 상쾌한 삭제 하 고 10 mL와 펠 릿 셀 resuspend prewarmed Y27632 보충 다른 관에서. 균등 하 게 세포 외 기질 단백질 코팅 10 cm 접시에 세포 현 탁 액을 확산. 트라이-가스 CO2 인큐베이터를 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2)에 있는 접시를 놓습니다. HiPSC 문화 낮은 산소 압력을 유지 합니다. 변경 매체 (Y27632 없이 mTeSR1) 매일. 바위 억제제 (Y27632) 단일 셀에 분리 후 즉시 hiPSC 생존을 위해 중요 하다. HiPSCs와 균등 하 게 분산 된 작은 집계로 세포 외 기질 단백질 코팅 표면에 고착 되 면 > 10% (이 일반적으로 접종 후 16 시간 이내 완료) confluency, Y27632는 불가결. Y27632 없이 해리 hiPSCs의 접종 후 너무 일찍 중간 변화는 거의 완전 한 세포 죽음을 발생할 수 있습니다. Passaging 액 pluripotency hiPSCs참고: 통로 효과적인 성장 지역 ~ 80%를 차지 하는 식민지 때 pluripotency hiPSCs을 끝났다. 올바른 뿌리고 절차 및 밀도 실험의 재현성에 대 한 중요 하다. 우리는 hPGCLC 유도의 효율성 크게 다르지 않다 hiPSC 문화 사이 언된 증권 (하나 또는 두 개의 구절을 포함) 또는 한 달 개시 후 6 일 본 (관련 > 10 구절). HPGCLC의 유도 효율성은 양적 평가 하지 비록 2 개월 이상 유지 하는 hiPSCs에서 성공적으로 수행 됩니다. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 분리 효소 혼합물의 4 mL를가지고 고 5 분 동안 실내 온도에 equilibrate. Prewarm 10 mL PBS(-) 15 mL 원심 분리기에 대 한 튜브 > 물 욕조에 37 ° C에서 5 분. 15 mL 원심 분리기 튜브에서 10 mL mTeSR1 매체를 2 µ L 50 mm Y27632 (락 억제제)를 추가 합니다. 바위 억제제 보충 10 mL 매체의 2 개의 관을 준비 하 고 같은 날에 사용. 또 다른 15 mL 원심 분리기 튜브에 Y27632를 추가 하지 않고 5 mL mTeSR1를 가져가 라. 5 분 동안 37 ° C 물 욕조에 Y27632 + prewarm 매체.참고: 단계 1.3.3에서에서 준비 하는 모든 중간 aliquots Y27632를 포함할 수 있습니다. Prewarmed 10 mL PBS(-) 한번 10 cm 접시와 린스 세포에서 오래 된 중간 발음 PBS(-)을 삭제 하 고 접시에 분리 효소의 4 mL를 추가 합니다. CO2 인큐베이터에 접시를 놓고 (트라이-가스 화기 작동 하지만 필요 하지 않습니다) 셀 바닥에서 분리 될 때까지 ~ 4 분. 단일 세포 현 탁 액을 만들기 위해 아래로 부드럽게 피펫으로 세포. HiPSC 단일 셀 서 스 펜 션 (15 mL 튜브에 총 볼륨은 약 9 mL) Y27632 없이 5 mL 매체를 포함 하는 prewarmed 튜브 전송. 원심 분리기 세포 현 탁 액, 300 x g 8 분 동안 실내 온도에. 상쾌한 삭제 하 고 Y27632를 포함 하는 prewarmed 중간 매체의 10 mL와 펠 릿 셀 resuspend. 40 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀 집계를 제거 하 고 셀 밀도 Coulter 카운터를 사용 하 여 결정 합니다. 106 세포는 세포 외 기질 단백질 코팅 10 cm 접시 접종을 10 mL에 x 3.0 달성 하기 prewarmed Y27632 보충 매체와 세포 현 탁 액을 희석. 트라이-가스 CO2 인큐베이터를 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2)에 접종된 접시를 놓습니다. 변경 매체 (Y27632 없이 mTeSR1) 매일. 2입니다. hPGCLCs 세대 참고: 10 cm 접시 (mTeSR1 매체, 기질 단백질 코팅)에 hiPSC 셀 ~ 80 %confluency (약 107 셀)에 도달 하면 다음 단계를 시작 합니다. 세포 외 기질 단백질 코팅 요리 (주 1)의 준비 얼음에 세포 외 기질 단백질의 한 약 수를 해 동 하 고 차가운 DMEM/F12 25 mL에 희석. 6 잘 플레이트 (1 mL/음)을 희석된 세포 외 기질 단백질을 분배. 한 약 수 24 웰 스 (4 판) 코트에 충분 하다. 적어도 1 시간 동안 실내 온도에 번호판을 품 어. 사용 하지 않는 코팅된 접시 봉인 고 1 주까지 동안 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 끝났다 pluripotency hiPSCs의 접종 직전 격판덮개에서 중간 발음 매체 또는 PBS(-) 코팅 설거지 필요는 없습니다. 세포 외 기질 단백질 코팅 접시 (1 일)으로 끝났다 pluripotency hiPSCs의 접종 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 분리 효소의 4 mL를가지고 고 5 분 동안 실내 온도에 equilibrate. Prewarm 10 mL PBS(-) 15 mL 원심 분리기에 대 한 튜브 > 물 욕조에 37 ° C에서 5 분. 35 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 mTeSR1 매체를 7 µ L 50 mm Y27632 (락 억제제)를 추가 합니다. Y27632 보충 매체를 사용 하 여 같은 날에. 총 70 mL Y27632 보충 매체에 대 한 두 개의 튜브를 확인 하 고 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 매체를 prewarm. Prewarmed 10 mL PBS(-) 한번 10 cm 접시와 린스 세포에서 오래 된 중간 발음 PBS(-)을 삭제 하 고 접시에 셀 분리 효소의 4 mL를 추가 합니다. CO2 인큐베이터에 접시를 놓고 (트라이-가스 화기 작동 하지만 필요 하지 않습니다) 셀 바닥에서 분리 될 때까지 ~ 4 분. 단일 세포 현 탁 액을 만들기 위해 아래로 부드럽게 피펫으로 세포. HiPSC 단일 세포 현 탁 액 10 mL Y27632 보충 매체를 포함 하는 prewarmed 튜브 전송. 원심 분리기 세포 현 탁 액, 300 x g 8 분 동안 실내 온도에. 상쾌한 무시 하 고 10 mL prewarmed Y27632 보충 매체와 펠 릿 셀 resuspend. 세포 현 탁 액 셀 집계 Coulter 카운터를 사용 하 여 셀을 셀 스 트레이너 (40 µ m 기 공 크기)을 통해 필터링. HiPSC 단일 세포 현 탁 액 50 mL prewarmed Y27632 보충 매체에 106 셀 x 5.0을 희석. 2 mL 세포 현 탁 액 (105 셀 x 2.0)에 각 잘 코팅된 6 잘 플레이트 (4 판, 24 웰 스)의 예방 셀에 각 잘 고르게 배포 됩니다 있는지 확인 합니다. 세포 배양 배지는 트라이 가스 CO2 인큐베이터 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2)에 배치 합니다.참고: inoculum 셀 밀도 각 분배 잘이 중요 합니다. 때문에 10 cm 요리에 hiPSCs의 접종은 다른 지역 보다 상당히 높은 세포 밀도 발생할 수 있습니다. HiPSCs 단일 셀의 셀 밀도 심지어 6 잘 플레이트와 더 쉽게 얻을 수 있습니다. 접종 후 24 시간에서 보통 (Y27632) 없이 2 mL/잘 mTeSR1으로 변경 합니다. 4i 순진한 (ERK-독립) 만능 세포 (3 일, 4 일)에 끝났다 pluripotency 상태 hiPSCs의 변환 50 mL 원심 분리기 튜브 (3 일, 4 일) 다음과 같이 4i 완전 한 순진한 pluripotency 매체 준비: 4i 기저 매체의 50 mL, 30 mM CHIR99021, 10 mM PD0325901, 20 mM BIRB796, 50 mM SP600125의 5 µ L의 5 µ L의 5 µ L의 5 µ L 그리고 50 m Y27632 m의 5 µ L.주: 냉장고에 하룻밤-80 ° C에서 녹여 4i 기저 매체를 저장 합니다. 즉시 사용 하기 전에 신선한 4i 완벽 한 매체를 준비 합니다. 4i 화학 물질 (CHIR, PD, BIRB, 및 SP)의 강한 빛에 노출을 하지 마십시오. 완전 한 4i를 저장 하지 마십시오 또는 하룻밤 냉동 4 ° C에서 중간 이상. 와 함께 15 분 변경 매체에 대 한 37 ° C 물에 따뜻한 50 mL 4i 완전 한 매체 접종 후 48 ~ 72 시간에서 4i 완전 한 매체 (2 mL/잘) prewarmed. 중간 변경의 정확한 타이밍은 높은 hPGCLC 수율 및 실험의 재현성을 달성 하기 위해 중요 합니다.참고: 4i hiPSC 문화의 밀도 높은이 조건 하에서 이며, 접종 후 48-72 시간에 confluent 될 하지만 이것은 정상입니다. EB 형성 microwell 플레이트 (주 5)를 사용 하 여 50 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에서 4i 완벽 한 매체를 준비 하 고 사용 하기 전에 ~ 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 그것을 prewarm. 35 mL DMEM/F12 사용 하기 전에 ~ 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 50 mL 원심 분리기 튜브 prewarm Microwell 접시를 준비 Microwell 플레이트의 8 활성 우물에 5% (w/v) 필터 소독 Pluronic F-127 세제를 추가 (참조 테이블의 재료; 0.5 mL/음). 실내 온도에, 1000 x g, 5 분 공기 방울의 부재를 보장 하기 위해 거꾸로 현미경으로 검사 microwells microwell 격판덮개 원심 Microwells 세제로 코트를 실 온에서 30 분 동안 microwell 접시를 둡니다. Prewarmed DMEM/F12를 pipetting와 린스 웰 스 microwell 격판덮개의 우물에서 세제 솔루션을 삭제 (2 mL/음). 실내 온도에, 1000 x g 5 분 공기 방울의 부재를 보장 하기 위해 거꾸로 현미경으로 검사 microwells microwell 격판덮개 원심참고: 때 공기 방울은 여전히 관찰 microwells에, microwell 시트는 여전히 확고 하 게 우물의 바닥에 붙어 있으면 검사. Prewarmed DMEM/F12를 pipetting와 린스 웰 스 microwell 격판덮개의 우물에서 DMEM/F12 취소 (2 mL/음). 2.4.3.4 2.4.3.3-단계를 반복 합니다. Microwell 플레이트 (1 mL/음)의 씻어 서 우물에 4i 완벽 한 매체를 추가 합니다. 37 ° C 물 욕조에 나머지 4i 완벽 한 매체를 유지. 실내 온도에, 1000 x g 5 분 공기 방울의 부재를 보장 하기 위해 거꾸로 현미경으로 검사 microwells microwell 격판덮개 원심 4i hiPSCs의 접종까지 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) 트라이 가스 인큐베이터에서 microwell 접시를 놓습니다. Microwell 격판덮개로 4i Ipsc의 접종 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 분리 효소의 13 mL를가지고 고 5 분 동안 실내 온도에 equilibrate. Prewarm 50 mL 50 mL 원심 분리기에서 PBS(-)에 대 한 튜브 > 물 욕조에 37 ° C에서 5 분. 순진한 hiPSC 세포 문화와 린스 셀의 한번 prewarmed 2 mL 24 우물에서 오래 된 매체를 발음/PBS(-)를 잘. PBS(-)을 삭제 하 고 0.5 mL/잘 분리 효소를 추가 합니다. 셀 바닥에서 분리 될 때까지 ~ 4 분 CO2 인큐베이터 (37 ° C)에서 세포 배양 배지를 놓습니다. 단일 세포 현 탁 액을 만들기 위해 아래로 부드럽게 피펫으로 세포. HiPSC 단일 셀 서 스 펜 션 prewarmed 20 mL 4i 완전 한 매체에 전송. 원심 분리기 세포 현 탁 액, 300 x g 8 분 동안 실내 온도에. 상쾌한 삭제 하 고 셀 펠 릿 5 mL prewarmed 4i 완전 한 매체와 resuspend. 세포 현 탁 액 셀 집계를 제거 하려면 셀 스 트레이너 (40 µ m 기 공 크기)을 통해 필터링. 3 번 1 mL prewarmed 4i 완전 한 매체와 셀 여과기를 세척. Coulter 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 9 mL prewarmed 4i 완전 한 매체에서 106 셀 x 27.0 32.4를 4i 순 hiPSCs의 단일 세포 현 탁 액을 희석. Note 그 4i 완전 한 매체 Y27632에 이미 포함 되어 있습니다. 트라이-가스 화기 (2.4.3.9)에서 8 4i 완전 한 매체의 1 mL를 포함 하는 microwell 접시를 가져가 라. 각 음에 1 mL 4i 순 hiPSC 서 스 펜 션 (3.0-3.6 x 106 셀/잘)을 접종. 이 셀 밀도 중요 합니다. 셀 부드럽게 pipetting으로 각 음에 고르게 배포 됩니다 있는지 확인 합니다. 실내 온도, 3 분 x 100g에 microwell 격판덮개 원심 트라이-가스 CO2 인큐베이터를 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2)에서 microwell 접시를 놓습니다. Microwells에서 수송과 세포를 방해 하지 마십시오. 24 ~ 30 시간에 대 한 셀을 품 어. 야간 보육 (~ 16 시간) 꽉 EBs의 형성에 대 한 일반적으로 충분 하지 않습니다. 락 문화 (주 6)에 대 한 낮은 부착 판 EBs의 전송 (하루 6-13 일) 다음과 같이 50 mL 원심 분리기 튜브에 hPGCLC 완전 한 매체를 준비:20 mL hPGCLC 기저 매체, 4 μ 500 m m 2-Mercaptoethanol, 20 mg/mL L-아 스 코르 빈 산의 50 μ, 100 μ g/mL의 50 m m Y27632, 50 μ의 4 μ의 재조합 인간 BMP4, 500 μ g/mL의 4 μ 인간의 SCF, 250 μ g/mL 인간 EGF의 4 μ 그리고 250 μ g/mL의 8 μ 인간의 LIF.참고: 사용 하기 전에 즉시 신선한 hPGCLC 완전 한 매체를 준비 하 고 빛에 노출 하지 마십시오. 완전 한 hPGCLC를 저장 하지 마십시오 또는 하룻밤 냉동 4 ° C에서 중간 이상.참고: BMP4의 농도 매우 높습니다. 최적의 BMP4 농도 BMP4의 일괄 처리 간의 달라질 수 있습니다. BMP4의 로트 차이 hPGCLC 생산을 강력 하 게 영향을 미칩니다. 완전 한 hPGCLC 매체에 BMP4의 부재, hPGCLCs의 비중은 매우 낮은6입니다. 완전 한 hPGCLC 매체에 있는 다른 사이토카인의 중요성은 한 나/Surani6에 의해 설명 되었다.참고:이 프로토콜의 완전 한 hPGCLC 매체에 인간의 LIF의 최종 농도 100 ng/mL6,10. 우리를 포함 한 이전 출판된 연구에 사용 된 최종 LIF 농도 1 μ g/mL 이었다. 때 인간의 LIF 시 약의 특정 활동은 > 10000 단위/μ g (에 드50 < 0.1 ng/mL), 100 ng/mL LIF EBs에서 hPGCLC 생성을 지원 하기 위해 충분 하다. EBs를 전송 5 mL hPGCLC 기저 매체와 20 mL hPGCLC 완전 한 매체에 대 한 prewarm > 물 욕조에 37 ° C에서 5 분. 조심 스럽게 셀 스 트레이너를 폴 리 프로필 렌 50 mL 원뿔 튜브 위에 거꾸로 놓습니다. 피펫으로 microwell의 각 잘 접시 접시 microwells에서 EBs 분리를 매우 부드럽게. EBs에서 포함 되지 않은 셀을 제거 하려면 셀 스 트레이너를 통해 각의 모든 내용을 필터링 합니다. 씻어 EBs prewarmed hPGCLC 기저 매체의 1 mL와 함께 셀 여과기에 유지 부드럽게 세척 5 회 반복 한다. 씻어 EBs 지금 50 mL 원뿔 튜브 거꾸로-다운에는 스 트레이너의 막에는 그대로 유지 됩니다. 셀 스 트레이너는 일반적으로 새로운 관에 배치 되도록 셀 여과기에 신선한 50 mL 원뿔 튜브를 놓습니다. 다음 신속 하 게 새로운 튜브 셀 거르는 반전. 셀 스 트레이너와 튜브는 지금 정상적인 위치에 있으며 EBs 셀 스 트레이너의 막 아래. 셀 스 트레이너의 막 위에서 18 mL prewarmed hPGCLC 완전 한 매체를 추가 하 여 원뿔 튜브에 EBs를 수집 합니다. 따라서, 매체는 멤브레인을 통과 하 고 EBs 원심 분리기 튜브의 맨 아래 막의 더 낮은 측에 수집. 낮은-첨부 6-잘 접시 (3 mL/음)의 우물으로 ebs 판 정지 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) 트라이 가스 인큐베이터에서 시 소-이동 로커에 낮은 첨부 접시를 놓습니다. 분 당 ~ 20 회전에서 락 속도 설정 합니다.참고: 때문에 소용돌이 운동 적용 되지 않습니다 우물과 퓨즈의 센터에서 EBs 집계. 되도록 EBs 집계 하지 않는 신중 하 게 흔드는 속도 조정 합니다. 너무 격렬 한 락 물리적으로 EBs를 손상 것 이다.참고: 낮은 산소 압력은 좋습니다 EB 문화에 대 한. EBs (주 7-13 일)의 표면에 hPGCLCs의 생성 갓 20 mL hPGCLC 완전 한 매체 매일 준비 합니다. 락, 없이 EBs 건조 EBs (~0.2 mL/잘 오래 된 매체 남아 있을 수 있습니다) 없이 ~ 1 분 제거 오래 된 매체에 우물의 바닥에 싱크대 것입니다 추가 신선한 hPGCLC 완전 한 매체 매일 (3 mL/음). 3. Immunohistochemical EBs (10 일-13 일)의 얼룩 세포 외 기질 단백질 블록 포름알데히드 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) immunostaining에 대 한 EBs를 포함 HPGCLCs OCT4로 식별 하기 위해+ 세포, 1.5 mL 낮은 바인딩 microcentrifuge 튜브에 EBs를 수확. EBs 바닥에 싱크 또는 간단히 실 온에서 (2 초)을 원심 및 매체를 삭제 하자. 린스 차가운 PBS(-)와 EBs. PBS(-)를 제거 하 고 차가운 1%(w/v) 나트륨 아 지 드 PBS(-)에 얼음에 5 분의 1 mL에 EBs를 품 어. EBs 바닥에 싱크 또는 간단히 실 온에서 (2 초)을 원심을 하자. 상쾌한, 무시 하 고 차가운 PBS(-)와 EBs를 헹 굴.참고: 나트륨 아 지 드의 세포내 단백질 및 RNA 사본을의 저하 속도가 느려집니다. 얼음에 세포 외 기질 단백질의 200 µ L를 녹여 고 EBs를 포함 하는 microcentrifuge 관에 추가 합니다. 젤 경화 될 때까지 ~ 10 분 동안 실내 온도에 튜브를 둡니다. PBS(-)에 4% 포름알데히드의 1 mL을 추가 하 고 부드러운 락과 15 분 동안 실 온에서 품 어.참고: 모두 EBs와 세포 외 기질 단백질이이 단계 동안 고정 됩니다. 고정, 없이 젤 블록 탈수 과정 중 분해 수 있습니다. 미리 고정된 EBs 젤 블록에 포함 된, EBs 젤 블록으로 다시 고정 하 고-고정 될 수 있습니다. 포름알데히드, 삭제 하 고 차가운 PBS(-) 한번 EBs를 헹 굴. 70% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 젤 포함 EBs 1 주일에 4 ° C에서 70% 에탄올에 저장할 수 있습니다. 프로세스 표준 FFPE 프로토콜 젤 포함 EBs. 5 μ m 두께 FFPE 슬라이드 준비. 슬라이드 하룻밤 건조 및 immunostaining까지 실내 온도에 그들을 저장 하자.참고: 우리의 일상적인 FFPE 프로토콜은 다음과 같습니다: 70% 에탄올, 2 개의 변화, 1 시간 각각; 80% 에탄올, 변경, 1 시간; 95% 에탄올, 변경, 1 시간; 100% 에탄올, 3 변화, 1.5 시간 각; 크 실 렌, 3 변화, 1.5 시간 각; 파라핀 왁 스 (58-60 ° C), 변화 2 2 시간. 탈수 조직은 파라핀 블록에 포함 되며 3-10 μ m (일반적으로 5 μ m)에서 잘라. 얼룩, 완전히 건조 한 Deparaffinize 적어도 30 분 동안 56 ° C 오븐에서 슬라이드 및 슬라이드 xylenes와 등급된 알코올 시리즈 화. 다음 5 분 동안 수돗물에 슬라이드를 씻어. 내 인 성 peroxidases을 비활성화, 10 분 동안 실내 온도에 BLOXALL 차단 솔루션 rehydrated 슬라이드를 품 어. 다음 슬라이드 PBS 가진 5 분 동안 세척. 20 분 동안 실내 온도에 보통 말 혈 청 (또는 다른 종 생성 된 이차 항 체의 정상적인 세라) 블록 슬라이드. 1 차 항 체를 하룻밤 4 ° C에서 PBS(-)에 0.1 %BSA 희석 안티-10 월-3/4 염소와 슬라이드를 품 어 (각 1 차 항 체에 대 한 희석 및 배양 조건 최적화). 다음 슬라이드 PBS(-)와 실내 온도, 5 분에 세 번 씻어. 30 분 동안 실내 온도에 (양 고추냉이 과산화 효소 활용 된 이차 항 체 말에 의해 생성 된; 참조 테이블의 재료) IgG 항 염소와 슬라이드를 품 어. 다음 슬라이드 PBS(-)와 실내 온도, 5 분에 세 번 씻어. 즉시 사용 하기 전에 필요한 금액 기판 ( 재료의 표참조)을 얼룩이 지는 소량을 혼합 하 고 완전 한 덩어리 얼룩이 솔루션 5 분 모니터 DAB는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 얼룩에 대 한 실 온에서 슬라이드를 품 어 반응을 중지합니다 때 OCT4+ 세포는 신속 하 게 슬라이드 흐르는 수도 물에 헹 궈 서 시각화 됩니다. 등급된 알코올 및 xylenes 시리즈와 함께 슬라이드를 탈수. 슬라이드는 레이저 캡처 서에 대 한 준비가 되었습니다. 설치 매체를 사용 하 여 영구 FFPE 슬라이드 준비 ( 재료의 표참조) 고해상도 현미경 관측을 위해. 4. EBs (10 일-13 일)에서 hPGCLCs의 FACS 농축 효소 혼합 Embryoid 몸 분리 키트 준비 준비 효소 혼합 1 50 µ L을 추가 하 여 효소 P 버퍼 X 및 소용돌이의 1900 µ L. 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 prewarm 효소 혼합 1. 10 µ L 효소 A 20 µ L Y 버퍼에 추가 하 여 효소 믹스 2를 준비 합니다. 믹스 효소 믹스 1과 완전 한 EB 분리 효소 혼합 준비 2. 출신과 EBs 낮은 첨부 접시와 2 분 삭제 상쾌한에 대 한 15 mL 원심 분리기 튜브에 실내 온도, 300 x g에서 원심 분리기에서 EBs를 수확 하 고 10 mL PBS(-)와 EBs를 resuspend. 다시 원심 분리기입니다. 상쾌한 무시 하 고 완전 한 EB 분리 효소 믹스 (4.1.3) EBs resuspend. EBs는 해리 될 때까지 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 EB 정지를 품 어. 외피, 부드럽게 피펫으로 EBs 분리를 촉진 하기 위하여 모든 3-5 분 동안 또는, 자동된 dissociator를 사용 하 여 Embryoid 몸 분리 프로그램. 해리 EB 세포 현 탁 액에 얼음 처럼 차가운 8 mL PBS(-)를 추가 합니다. 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 1 mL로 세척 셀 여과기 차가운 PBS(-) 3 시간. Coulter 카운터를 사용 하 여 필터링 된 셀에에서 셀을 계산 합니다. 4 ° c, 8 분에 대 한 300 x g에 세포 현 탁 액을 원심 하 고 상쾌한 삭제. 얼음 처럼 차가운 10 mL PBS(-)와 셀 펠 릿 resuspend 두 개의 튜브, 아니 얼룩 제어 (10 ~5 셀)과 안티 CD38 얼룩 (모든 나머지 셀)에 대 한 다른으로 세포 현 탁 액을 나눕니다. 4 ° c, 300 x g 8 분에 대 한 두 개의 튜브 원심 안티-CD38 얼룩 및 hPGCLCs FACS 농축 PBS(-)에서 200 µ L 얼음 3% (w/v) BSA 아니 얼룩 제어를 위한 펠 릿 셀과 1% (w/v) 나트륨 아 지 드를 resuspend. Cytometry까지 얼음에 놓습니다.참고: 나트륨 아 지 드의 추가 셀 표면에서 CD38의 국제화 속도가 느려집니다. 안티-CD38 얼음 3% (w/v) BSA와 1% (w/v) 나트륨 아 지 드 PBS(-)에 100 µ L 당 1 x 106 세포를 얼룩이 지기 펠 렛 셀 resuspend FACS 학년, 안티-CD38 APC 활용 된 항 체의 1 x 106 셀 당 10 µ L를 추가 합니다. 커버 알루미늄 호 일로 빛에 노출을 피하기 위해 튜브. 부드러운 락과 45 분 4 ° C에서 품 어. 5 mL을 추가 300 g 8 분 삭제 상쾌한 및 resuspend 셀 x 5 mL와 함께 작은 얼음 PBS(-) 및 4 ° C에서 원심 분리기, 얼음 PBS(-). PBS(-) 세척 총에 세 번 반복 합니다. FACS에 대 한 적절 한 셀 밀도 500 μ 얼음 3% (w/v) BSA와 1% (w/v) 나트륨 아 지 드와 펠 릿 셀 PBS(-)에 resuspend. 풍요롭게 CD38로 hPGCLCs+ 세포, 일반적으로 명확 하 게 고유 세포 인구를 형성. CD38의 식별을 보장 하기 위해 노 얼룩 컨트롤을 사용 하 여+ 세포. HPGCLCs의 일반적인 항복 하루 10 EBs에서 모든 FACS 검사 단일 셀의 1-5% 이며 하루 13 EBs에서 20-40%입니다.