Assay לוציפראז תפוקה גבוהה כדי להעריך את Proteolysis של PCSK9 יחיד-מחזור פרוטאז
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את פעילות הפרוטאוליטי פרוטאז תחלופה נמוכה-פעילות מהותית, יחיד בהקשר הסלולר. באופן ספציפי, שיטה זו מוחלת כדי להעריך את הפעילות הפרוטאוליטי של PCSK9, נהג מפתח של מטבולי הפעילות הפרוטאוליטי נדרש עבור תפקידה hypercholesterolemic האולטימטיבי.
Abstract
סוג סבטיליזין/kexin proprotein convertase 9 (PCSK9) הוא פרוטאז יחיד-מחזור אשר מווסת את רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) בסרום, וכתוצאה מכך מחלות לב וכלי דם. למרות PCSK9 proteolysis נדרשת עבור השפעתו hypercholesterolemic מלאה, הערכת פונקציית הפרוטאוליטי שלה הוא מאתגר: PCSK9 ידועה רק קליב עצמו עובר רק מחזור אחד, לאחר proteolysis, משמרת את המצע שלה ב אתר פעיל שלה כמו מעכב באופן אוטומטי. השיטות המובאות כאן לתאר וזמינותו אשר מתגבר על האתגרים הללו. הבדיקה מתמקדת proteolysis הבין-מולקולרי ההקשר מבוססת תא, המחשוף מוצלחות קישורים לפעילות לוציפראז המופרש, אשר ניתן בקלות לקרוא המדיום ממוזגים. דרך שלבים רציפים של מוטגנזה מכוונת, תרביות תאים ארעית של הבדיקה לוציפראז, וזמינותו יכול לחקור PCSK9 proteolysis בתנאים של ההפרעות גנטיות או מולקולרית באופן תפוקה גבוהה. מערכת זו היא מתאימה עבור הערכת בשני הביוכימי missense קלינית שהתגלו נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים (SNPs), כמו גם באשר ההקרנה של מעכבי מולקולה קטנה של PCSK9 proteolysis.
Introduction
PCSK9 מטרות קולטן LDL (LDL-R) עבור השפלה, העלאת הכולסטרול LDL (LDL-C) ונהיגה טרשת עורקים מחלות לב1,2. PCSK9 מיקוד הרפוי robustly להוריד את LDL-C, לשפר את התוצאות לב וכלי דם לחולים, אפילו בעת הוספת טיפול אגרסיבי להורדת שומנים בדם עם סטטינים3,4. אולם, כיום שאושרו טיפולים מוגבלות לנוגדן מבוססי גישות, סובלים מחוסר משתלמת5,6. כדי לפתור בעיה זו, פחות יקר חלופות טיפוליות, אמצעי לזיהוי חולים עשויה להרוויח יתרונות גדולים יותר, או שניהם, נדרשים.
גישות מולקולה קטנה יכולה מטרה תאיים PCSK9, מספקים נתיב משופרת של הממשל, לצמצם עלויות, שהופך אותם “הגביע הקדוש” זה באיזור7. עם זאת, PCSK9 הוכיח שקשה סמים על ידי מולקולות קטנות. כמו פרוטאז, מיקוד פונקציית הפרוטאוליטי של PCSK9 היא אסטרטגיית אטרקטיבי, כפי העצמי-proteolysis היא הצעד הגבלת קצב ההבשלה PCSK98 והוא נדרש לקבלת אפקט מקסימלי שלה ב- LDL-R9. עד כה, עם זאת, אסטרטגיה זו לא היה מוצלח, ככל הנראה בגלל הביוכימיה הייחודית של PCSK9: PCSK9 cleaves רק עצמו10, ביצוע תגובה אחת-מחזור, לאחר העצמי-המחשוף, PCSK9 prodomain כבולים בתוך האתר הפעיל כמו auto-מעכב11, מונע את המדידה של כל פעילות נוספת פרוטאז.
מאמר זה מציג שיטה להעריך פונקציית הפרוטאוליטי PCSK9 אופנה תפוקה גבוהה8. דרך מוטגנזה, חוקרים יכולים להשתמש assay הזה כדי לחקור את ההשפעות של קידוד SNPs נמצאו במרפאה כדי להעריך אותם על ההשפעות על proteolysis, השלב הגבלת קצב ההבשלה PCSK9. בנוסף, שיטה זו תהיה שימושית בעיצוב של מסכי תפוקה גבוהה לזיהוי מאפננים של PCSK9 proteolysis, אשר נמצאים צפוי בסופו של דבר לשבש את המצגת של PCSK9 ה-LDL-r (ו לווסת את אפקט hypercholesterolemic של PCSK9) . לבסוף, פרוטוקול זה ניתן להתאים אחרים פרוטאזות עם פעילות מהותית נמוך, ובלבד i) זוג סובסטרט מסוים-פרוטאז ניתן למצוא, ii) עוגן תאיים מתאים יכול להתבסס על המצע.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניסיוני בהליכים המתוארים לעיל להציג שיטה להתגבר על הפעילות נמוך מהותית הפרוטאז יחיד-מחזור PCSK9 ולהעריך את פונקציית הפרוטאוליטי בצורה איתנה. המושג מפתח וזמינותו נשענת על המרת אירוע יחיד-מחזור readout enzymatically מוגבר. נקודות החוזק של וזמינותו כוללים את מסגרת זמן קצר יחסית קלות השימוש של הכתב לוצי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים את התמיכה מימון נדיב מן NHLBI/NIH (K08 HL124068 ו- HMOT1243 אימייל), NCATS/NIH דרך UCSF קלינית Translational המדע מכון זרז לתוכנית (UL1 TR000004), הסנאט אקדמי UCSF, קרן הלמן, תודה גלעד מדעי מחקר מלומד פרס, פרס לב וכלי דם מתאווים פייזר (הכל אל חריפה ס ג’ון), הווארד יוז המכון הרפואי (ועד גיא טל מ Galvan וקוואן לשווקת מ’).
Materials
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Autores | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Autores | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
Referências
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 – A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
