אפיון פיסי ברזולוציה גבוהה של חלקיקים מתכתיים בודדים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות אשכולות בעלי חמצן מתכת דיסקרטית, polyoxometalates (פופונים), במגבלת המולקולה היחידה באמצעות פלטפורמה אלקטרונית מבוססת nanopore ביולוגי. השיטה מספקת גישה משלימה לכלי כימיה אנליטיים מסורתיים המשמשים בחקר מולקולות אלה.
Abstract
מולקולות בודדות ניתן לזהות מאופיין על ידי מדידת התואר שבו הם להפחית את הזרם יונית זורם דרך נקבובית אחת בקנה מידה של ננו. האות אופייני לתכונות הפיסיוכימיות של המולקולה ולאינטראקציות עם הנקבובית. אנו מדגימים כי הnanopore שנוצר על ידי חלבון חיידקי אקסוטוקסין סטייהילוקוקוס אלפא המוליזה (αHL) יכול לזהות polyoxometalates (האתר, מתכת אנייונית אשכולות חמצן), על גבול המולקולה היחידה. יתר על כן, מוצרים השפלה מרובים של 12-phosphotungstic חומצה פום (וועד ההורים, H3pw12O40) בפתרון מדודים בו. הרגישות של המולקולה היחידה של השיטה הnanopore מאפשרת להפונים להיות מאופיינים בריכוזים נמוכים באופן משמעותי מהנדרש לתהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיית. טכניקה זו יכולה לשמש ככלי חדש עבור כימאים כדי ללמוד את התכונות המולקולריות של פוליוקסונים או אשכולות מתכתיים אחרים, כדי להבין טוב יותר את התהליכים הסינתטיים של פום, ואולי לשפר את התשואה שלהם. באופן היפותטי, המיקום של אטום נתון, או סיבוב של רסיס במולקולה, ואת המצב חמצון מתכת יכול להיות נחקר עם שיטה זו. בנוסף, טכניקה חדשה זו יש את היתרון של המאפשר ניטור בזמן אמת של מולקולות בפתרון.
Introduction
מזהה אנליטים ביוקולריות ברמת המולקולה היחידה ניתן לבצע באמצעות nanopores ומדידת הנוכחי מודולים יוניים. בדרך כלל, nanopores מחולקים לשתי קטגוריות מבוסס על הייצור שלהם: ביולוגי (המורכב עצמית מחלבון או DNA אוריגמי)1,2,3, או מוצק מדינה (למשל, מיוצר עם כלי עיבוד מוליך למחצה)4,5. בעוד מוצק מדינה nanopores הוצעו ככל האפשר חזק יותר פיזית וניתן להשתמש באמצעות מגוון רחב של תנאי פתרון, nanopores החלבון עד כה להציע רגישות יותר, התנגדות יותר להתמוך, רוחב פס גדול יותר, כימיה טובה יותר בסלקטיביות, וסימן גדול יותר ליחס הרעש.
מגוון של ערוצי יון החלבון, כגון האחד שנוצר על ידי האוראוס של סטיילוקוקוס α-המוליזה (αHL), ניתן להשתמש כדי לזהותמולקולות יחיד, כולל יונים (למשל, H+ D+)2,3, פולינונודים (DNA ו-RNA)6,7,8, נזק ל-DNA9, פוליפפטידים10, חלבונים (מקופלים ונפרשו)11, פולימרים (פוליאתילן גליקול ואחרים)12,13 , 14, זהב חלקיקים15,16,17,18,19, ועוד מולקולות סינתטי20.
הדגמנו לאחרונה כי αHL nanopore יכול גם בקלות לזהות ולאפיין אשכולות מתכתיים, polyoxometalates (הפונים), ברמת המולקולה היחידה. פופון הם אשכולות בדידים של חמצן ננו-סקאלה מתכת שהתגלו ב 182621, ומאז, סוגים רבים יותר כבר מסונתז. בגדלים שונים, מבנים, קומפוזיציות אלמנטלים של polyoxometalates כי הם זמינים כעת מוביל מגוון רחב של מאפיינים ויישומים כולל כימיה22,23, זרז24, חומר המדע25 ,26, ומחקר ביו-רפואי27,28,29.
הסינתזה של פום היא תהליך של הרכבה עצמית הנעשית בדרך כלל במים על ידי ערבוב כמויות נדרשות של מלחי מתכת של monomeric. לאחר הקמתה, מציגה מגוון גדול של גדלים וצורות. לדוגמה, מבנה הקגין פוליאניב, XM12O40q- מורכב מאחד הטרואטום (X) מוקף בארבעה אוקסיגנס כדי ליצור טטרהדרון (q הוא החיוב). הטרואטום ממוקם במיקום מרכזי בתוך כלוב שנוצר על ידי 12 מעבר ה, מתכות המעבר במצב החמצון הגבוה שלהם, אשר מקושרים זה לזה על ידי אטומי חמצן השכנה משותף. בעוד מבנה הטונגסטן polyoxometalates יציב בתנאים חומציים, יוני הידרוקסיד להוביל את המחשוף הידרוליטי של חמצן מתכת (M-O) איגרות חוב30. תהליך מורכב זה מביא לאובדן של אחד או יותר משני מבני-האדם, המובילים להיווצרות מינים חד-שלריים ומלאים, ובסופו של דבר לפירוק המלא של הפופון. הדיון שלנו כאן יהיה מוגבל למוצרי פירוק חלקי של חומצה 12-phosphotungstic ב-pH 5.5 ו 7.5.
המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות אשכולות חמצן דיסקרטית מתכת במגבלת המולקולה היחידה באמצעות פלטפורמה אלקטרונית מבוססת nanopore ביולוגית. שיטה זו מאפשרת זיהוי אשכולות מתכתיים בפתרון. מינים רבים בתמיסה יכולים להיות מופלים ברגישות רבה יותר מאשר שיטות אנליטיות קונבנציונליות33. עם זאת, הבדלים עדינים במבנה פום ניתן להבהיר, ובריכוזים נמוכים במידה ניכרת מאלה הנדרשים עבור ספקטרוסקופיית NMR. חשוב מכך, גישה זו אפילו מאפשרת את האפליה של צורות איזואריק של Na8hpw9O341.
Protocol
Representative Results
Discussion
עקב הטעינה האנייונית שלהם, כנראה שפופון מקשר בין העברת מונים אורגניים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטית. לכן, חשוב לזהות את תנאי הפתרון המתאימים ואת סביבות האלקטרוליט הנכונות (בעיקר הקטשות בפתרון) כדי להימנע ממערך מורכב עם הפופון. דרושה טיפול מיוחד בבחירת המאגר. לדוגמה, קצב הלכידה של הפופו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה על התמיכה הפיננסית מארגון הביולוגיה המולקולרית האירופאית למענק פוסט-דוקטורט (לJ.E.) ומענק מ-NIH ננגרי (עד J.J.K.). אנו מעריכים את עזרתם של פרופסורים ג’ינגיואה ג ‘ ו וסרגיי Kalachikov (אוניברסיטת קולומביה) למתן הαHL, ועל השראה דיונים עם פרופ ‘ יוסף ריינר (אוניברסיטת וירג העמים).
Materials
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
Referências
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J. Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel. Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).
- Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations. Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).
- Please, T. R., Ayub, M. Solid-State Nanopore. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 121-140 (2013).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature Nanotechnology. 2 (4), 209-215 (2007).
- Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).
- Akeson, M., et al. Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules. Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).
- Singer, A., Meller, A. Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes. Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).
- Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an α-hemolysin nanopore. Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).
- Halverson, K. M., et al. Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).
- Oukhaled, G., et al. Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording. Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).
- Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).
- Robertson, J. W. F., et al. Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).
- Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -. K., Rühe, J., Behrends, J. C. Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray. ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).
- Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters. Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).
- Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore. Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).
- Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry. Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).
- Campos, E., et al. Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the α-hemolysin nanopore. Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).
- Campos, E., et al. The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the α-hemolysin nanopore. Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).
- Baaken, G., et al. High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore. ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).
- Berzelius, J. J. Beitrag zur näheren Kenntniss des Molybdäns. Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).
- Long, D. -. L., Burkholder, E., Cronin, L. Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices. Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).
- Muller, A., et al. Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies. Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).
- Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting. Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).
- Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications. Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).
- Busche, C., et al. Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters. Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).
- Pope, M., Müller, A. . Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, (2012).
- Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F. Polyoxometalates in medicine. Chemical Reviews. 98 (1), 327-358 (1998).
- Gao, N., et al. Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer’s disease. Nature Communications. 5, 3422 (2014).
- Pope, M. T. . Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, (1983).
- Braha, O., et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chemistry & Biology. 4 (7), 497-505 (1997).
- Forstater, J. H., et al. MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data. Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).
- Balijepalli, A., et al. Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements. ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).
- Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel. Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).
- Piguet, F., et al. Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore. Nature Communication. 9 (966), (2018).
