ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا تجريبية التي يمكن أن تستخدم لتحديد الانتماءات الملزمة وطريقة التفاعل البروتين ملزمة فسفوليبيد خالية من تسمية annexin A2 مع المعطل تداولها المدعومة من الصلبة بيلاييرس (SLB) عن طريق قياس في وقت واحد الإقبال الجماهيري وخصائص لزج مطاطي من البروتين أنيكسين A2.
Abstract
تقنية ميكروبالانسي المسرف الكوارتز الكريستال نهج بسيطة وخالية من التسمية لقياس خصائص الامتصاص ولزج مطاطي الشامل من كتلة استوعبت معطلة على الأسطح الاستشعار، مما يسمح قياسات للتفاعل في وقت واحد من البروتينات مع السطوح الصلبة المدعومة، مثل بليرس الدهن، في الوقت الحقيقي وحساسية عالية. أنيكسينس هي مجموعة يحافظ على درجة عالية من البروتينات فسفوليبيد الملزمة التي تتفاعل مع هيدجروبس مشحونة سلبا عبر عكسية تنسيق أيونات الكالسيوم. هنا، يمكننا وصف بروتوكول التي استخدمت لتحليل كمي ربط annexin A2 (AnxA2) للدهن مستو بليرس أعد على سطح جهاز استشعار الكوارتز. هذا البروتوكول هو الأمثل للحصول على بيانات قوية واستنساخه، ويتضمن وصفاً مفصلاً خطوة بخطوة. يمكن تطبيق الطريقة أخرى ملزمة غشاء بروتينات والتراكيب بلير.
Introduction
الأغشية الخلوية هياكل حيوية للغاية ومعقدة. تجميع خليط مركب من الدهون غشاء، جنبا إلى جنب مع بروتينات الغشاء المرتبط محيطيا و/أو عضويا، بشكل ميكرودومينس. وتشارك المنظمة الإيقاع المكانية المنسقة لهذه ميكرودومينس الغشاء في العمليات الفسيولوجية الرئيسية1. هي تحرك غشاء ميكرودومين ديناميات التفاعل بين الغشاء الدهون، فضلا عن قدرة بروتينات الغشاء المحيطي للاعتراف وتتفاعل مع الدهون التي أثرت في ميكرودومينس. توظيف البروتينات الدهون محددة غالباً ما يتحقق عن طريق وحدات الاعتراف بالدهن، مثل التماثل بليكسترين (PH) أو2،3مجالات C2. الأساليب التحليلية الفيزيائية الحيوية باستخدام نموذج الأغشية مفتاح لفهم المبادئ الأساسية التي تحكم هذه العمليات على المستوى الجزيئي.
أنيكسينس، مولتيجيني-أسرة كبيرة، معروفة لقدرتها على ربط الدهون غشاء مشحونة سلبا، غالباً فوسفاتيديلسيريني (PS)، في Ca2 +-التحكم في طريقة2. السمة المميزة الثانية للأسرة أنيكسين هو وجود شريحة الهيكلية مصانة، أنيكسين كرر، هو الحالي أربع أو ثماني مرات، والمرافئ Ca2 +-والملزمة فسفوليبيد مواقع4. Ca2 +-يضع تفاعل الدهون تعتمد أننيكسينس في وضع مثالي للشعور وانقل Ca2 +-بوساطة إشارات للأغشية المستهدفة. الدوام، أنيكسينس قادرون على الحث على تشكيل ميكرودومينس أثري في نسبة الكولسترول في الدم، فوسفاتيديلينوسيتول-4، 5-بيسفوسفاتي (PI (4، 5) ف2) و PS، سواء في الأغشية الخلوية و/أو اصطناعية نظم5. ويصف هذا البروتوكول نهج لتحليل التفاعل غشاء أنيكسين استخدام7،،من6“كريستال الكوارتز ميكروبالانسي تبديد” (قكم-د)8.
هو المكون الأساسي في هذا ميكروبالانسي كريستال تتأرجح بمثابة سطح الاستشعار. الامتزاز و/أو ربط الجزيئات على السطح استشعار إنقاص تردد صدى (و) متناسبة مع الزيادة في الكتلة. إذا كان السطح فهي مغلفة بالتساوي مع فيلم، ربط المواد الإضافية قد تتداخل مع السلامة الهيكلية لهذه الطبقة، ويمكن رصد هذه التغيرات في فيسكولاستيسيتي (عنصر تبديد الطاقة د) بالإضافة إلى ذلك. وهذا أسلوب على نطاق واسع لدراسة التفاعل بين البروتينات الدهنية بليرس. في هذا النهج، يتم استيعابها الحويصلات الدهنية إلى سطح الاستشعار المغلفة بشكل مناسب. دهن بلير تشكيل مواتية في المواد القائمة على السليكا9،10، كما حويصلات لا تمزق غالباً على الأسطح الأخرى ماء، مثل الذهب11 تتأكسد بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية-الأوزون، TiO212أو ال 2س313. النشرات تمزق الحويصلات اندماج المرحلة المائية، مما يؤدي إلى تغييرات مميزة في الكتلة وتبديد. توليد بليرس المدعومة من الصلبة (SLB) طريق الانصهار حويصلة بسيطة وقوية، ويمكن استخدامها لتوليد النماذج المعقدة التي تحاكي الأغشية الخلوية.
ميكروبالانسي المسرف الكوارتز الكريستال أسلوب خال من التسمية والحساسة. وميزة رئيسية هي إمكانية معطف أي المواد التي تنشئ طبقة رقيقة بما فيه الكفاية على السطح، مما يوفر مجموعة واسعة من التطبيقات في مجالات البحوث المتنوعة. ولوحظ التفاعل البروتين-الأغشية في الوقت الحقيقي، ويمكن تحليل النتائج مباشرة. يمكن استخدام سطح الاستشعار نفسه في القياسات اللاحقة (بعد إجراء التنظيف الحد الأدنى كما هو مبين في هذا البروتوكول)، مما يسمح لضوابط داخلية دقيقة وقابليتها لمقارنة بين تحليلها.
Protocol
Representative Results
Discussion
للإجابة على الأسئلة المتعلقة بعلاقة بنية-وظيفة الأغشية الخلوية بطريقة كمية ونوعية، خلية علم الأحياء أرباح هائلة من استخدام النهج الفيزيائية الأحيائية على أساس راسخ والتقنيات المستخدمة على نطاق واسع ، بما في ذلك الذري القوة مجهرية (فؤاد)، صدى السطحية مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة)، وتستخدم تقنية قكم-د هنا. أظهرنا في الدراسات السابقة التي تربط البروتينات أنيكسين في كاليفورنيا2 +-طريقة تعتمد على الغشاء المعطل تداولها مع تقارب عالية. ونحن نستخدم التردد وتبديد التحولات من يغلب السابع (Δf7) لأن هذا يمثل أفضل حل وسط للكشف عن حساسية والتذبذب الاستقرار.
ويسمح هذا الأسلوب أيضا وصفاً كمياً لتفاعل بروتين غشائي. AnxA2 ملزم للغشاء يتسم بالإيجابية كوبيراتيفيتي الذي هو توسط المجال الأساسية annexin المصانة ويعتمد على وجود نسبة الكولسترول في الدم. بالتفصيل في مكان آخر البيانات الكمية التي تم الحصول عليها لترد AnxA2 و AnxA8 في6،8.
هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. استخدام الدهنية الفور؛ خلاف ذلك، قد تلتحم حويصلات صغيرة في حويصلات أكبر مع التوتر السطحي أقل، مما يؤدي إلى تثبيط تشكيل بلير الدهن. الحفاظ على درجة حرارة ثابتة خلال القياسات. نتائج كل انحراف صغير في درجة الحرارة في تحول التردد وتبديد لا يكاد يذكر. تجنب فقاعات الهواء؛ وبخلاف ذلك، النظام غير مستقر، ولن تقيم خط أساس.
المعادلة ساوربري يسمح التحويل المباشر لتكرار الملاحظة يتغير إلى التغيرات في الكتلة، وهو، لذلك، تستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك، يحمل افتراض ارتباط خطي بين التغير في تردد صدى والشامل وأضاف فقط صحيح بالنسبة للعناصر التي تشكل فيلم جامدة وموحدة على سطح جهاز الاستشعار. لا يمكن استخدامه للزج مطاطي الممتزات مثل الأفلام البروتين الغنية بالمياه، والطبقات الدهنية بالماء، وأدرجت معادلة ساوربري أو حتى تمتز الخلايا. هنا، أكثر تعقيداً من النماذج الرياضية المطلوبة. ولذلك، أنها بالغة الأهمية لرصد التغييرات في نفس الوقت في التردد وتبديد. للكشف عن التغيرات الهيكلية أثناء أخذ القياس، يمكن رسم ΔD مقابل نسب Δf، مع خط مستقيم مما يشير إلى لا تغييرات كونفورماشونال.
وميزة رئيسية لهذا الأسلوب هي إمكانية استخدام مجموعة واسعة جداً من المواد بمثابة ركائز. وعلاوة على ذلك، أنها طريقة موثوق بها ومباشرة لدراسة طائفة واسعة من التفاعلات بين الجزيئات، كتشكيل مناسب للأفلام طلاء السطح (مثل SLB)، فضلا عن زيادة تفاعلات البروتينات الدهنية، يمكن رصدها على الإنترنت.
هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على غيرها من البروتينات الغشاء التفاعل، على سبيل المثال، شريط المجال البروتينات19، (ezrin وراديكسين وموسين) ERM الأسرة البروتين له دور هام في غشاء سيتوسكيليتون الربط20،21 ،22، أو البروتينات التي تحتوي على نطاقات C2 أو الأس الهيدروجيني. وعلاوة على ذلك، مجموعة واسعة من التطبيقات لهذه التقنية لدراسة المواد البيولوجية قد تم بنجاح نشر، وبالتالي إنشاء قكم كمنصة تجريبية مناسبة تماما دراسة التفاعلات التجميعات الجزيئات أكثر تعقيداً أو حتى الخلايا،من2324.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل الأوقيانوغرافية Deutsche تحت منح SFB 858/B04 و EXC 1003 SFB 1348/A04 SFB 1348/A11.
Materials
| Chemicals | |||
| Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
| Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
| HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
| Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
| PiP2 | Avanti | 850155P | |
| POPC | Avanti | 850457P | |
| POPS | Avanti | 840034P | |
| Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
| SDS | Roth | 183 | |
| Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
| Equipment | |||
| Extruder Liposofast | Avestin | ||
| Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
| QSense Dfind | Qsense | ||
| Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
| QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
| PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
| OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |
Referências
- Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-41 (2000).
- Gerke, V., Creutz, C. E., Moss, S. E. Annexins: linking Ca2+ signalling to membrane dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 449-461 (2005).
- Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends in Biochemical Science. 37, 526-533 (2012).
- Rescher, U., Ruhe, D., Ludwig, C., Zobiack, N., Gerke, V. Annexin 2 is a phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate binding protein recruited to actin assembly sites at cellular membranes. Journal of Cell Science. 117, 3473-3480 (2004).
- Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: from structure to function. Physiological Reviews. 82, 331-371 (2002).
- Heitzig, N., et al. Cooperative binding promotes demand-driven recruitment of AnxA8 to cholesterol-containing membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (4), 349-358 (2018).
- Drücker, P., Grill, D., Gerke, V., Galla, H. J. Formation and characterization of supported lipid bilayers containing phosphatidylinositol-4,5-biphosphate and cholesterol as functional surfaces. Langmuir. 30, 14877-14886 (2014).
- McConnell, H. M., Watts, T. H., Weis, M. R., Brian, A. A. Supported planar membranes in studies of cell-cell recognition in the immune system. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Biomembranes. 864, 95-106 (1986).
- Anderson, T. H., et al. Formation of supported bilayers on silica substrates. Langmuir. 25, 6997-7005 (2009).
- Pfeiffer, L., Petronis, S., Koper, I., Kasemo, B., Zach, M. Vesicle adsorption and phospholipid bilayer formation on topographically and chemically nanostructured surfaces. Journal of Physical Chemistry B. 114, 4623-4631 (2010).
- Cho, N. J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: a comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
- Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. J. Self-Assembly formation of lipid bilayer coatings on bare aluminium oxide: overcoming the force of interfacial water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
- Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta(BBA) – Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
- Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of lipid vesicle deposition on solid surfaces: a combined QCM-D and AFM study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
- Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
- Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik A Hadrons and Nuclei. 155 (2), 206-222 (1959).
- Rodahl, M., Höök, F., Krozer, A., Brzezinski, P., Kasemo, B. Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q-factor measurements in gaseous and liquid environments. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3924-3930 (1995).
- Drücker, P., Pejic, M., Grill, D., Galla, H. J., Gerke, V. Cooperative binding of annexin A2 to cholesterol-and phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate-containing bilayers. Biophysical Journal. 107 (9), 2070-2081 (2014).
- Galic, M., et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 276-287 (2010).
- Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
- Bianco, M., et al. Quartz crystal microbalance as cell-based biosensor to detect and study cytoskeletal alterations and dynamics. Biotechnology Journal. , 1700699 (2018).
- Chen, J. Y., Penn, L. S., Xi, J. Quartz crystal microbalance: Sensing cell-substrate adhesion and beyond. Biosensors and Bioelectronics. 99, 593-602 (2018).
- Bragazzi, N. L., et al., Donev, R., et al. Quartz-Crystal Microbalance (QCM) for Public Health: An Overview of Its Applications. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 101, 149-211 (2015).
