Uzun vadeli bir kültür model sığır granulosa hücre serum-Alerjik koşullar altında açıklanmıştır. Araştırmacılar farklı kaplama yoğunlukları östrojen üretimi ve özellikleri olarak etkileri çeşitli faktörler ve koşulları incelemek bu modeli verir sığır granulosa hücreleri.
Yumurtalık granulosa hücreleri (GC) estradiol sentez önemli kaynağıdır. Preovulatory luteinizan hormon (LH) dalgalanma tarafından indüklenen, hücreleri granulosa ve, özellikle, granulosa hücre katmanı derinden onların morfolojik, fizyolojik ve moleküler özelliklerini değiştirmek ve progesteron üretimi gövde formu luteum gebelik bakımından sorumludur. Hücre kültür modelleri temel düzenleyici mekanizmaları folliculo luteal dönüşüm içinde yer alan eğitim için gerekli araçları vardır. Yalıtım yordam ve köklerinin (< 6 mm) küçük ve orta boyutlu dan bovine GC dondurma sunulan Protokolü odaklanır. Bu teknik ile GC neredeyse saf nüfusu elde edilebilir. Dondurma işlemi büyük ölçüde zaman hücre kültürü yönetiminin bağımsız olarak doğrudan birincil doku (yumurtalık) tedarik kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı sığır GC estradiol aktif durumunu taklit eden bir serum serbest hücre kültür modeli açıklar. Başarılı steroid-aktif hücre kültürü için gerekli olan önemli koşulları boyunca protokolünün ele alınmıştır. Hücreleri kaplama yoğunluğu artan belirli bir tepki bir değişmiş gen ifade profil ve hormon üretimi tarafından belirtildiği şekilde indükler gösterilmiştir. Ayrıca, bu modeli daha da GC farklılaşması üzerine çalışmalar için bir temel oluşturur ve diğer uygulamaları sağlar.
Farklı somatik foliküler hücre tipleri ince ayarlanmış ve iyi orkestra moleküler değişiklikler başarılı yumurtlama ve luteinization bağlıdır. Bu gelişim süreçleri ayrıntılarını tam olarak henüz anlaşılır değil beri daha fazla açıklama gereklidir. Vivo yaklaşımlar ayrıntılı ve pahalı ve özellikle, folliculogenesis sırasında ortaya çıkan adresi belirli moleküler mekanizmaları için başarısız. Bu nedenle, reductionistic vitro modelleri Ayrıca, hücresel ve moleküler ayrıntıları içgörü sağlamak için ihtiyaç vardır. Farklı çalışmalar Kültür bağlamında vitro fertilizasyon teknikleri1,2,3, Bütün köklerinin açıklar. Araştırmacılar farklılaşma mekanizmalar baktılar olduğundan, birçok çalışma foliküler GC üzerinde odaklanın. Bu hücreler, oosit ile doğrudan ilişkili östrojen üretiminin önemli kaynaklarıdır ve böylece, folliculogenesis ve luteinization4boyunca önemli bir rol oynamaktadır.
GC satırlarının farklı türlerden geliştirilmiştir hücre ölümsüzleştirdi. Bunların çoğu, ancak, yeterli bir steroid hormon üretimi5göstermek değil. Şimdiye kadar sadece bir telefon hattı GC oldu sığır6kurulan ama bu satırı steroidogenic faaliyete çeşitli pasajlar7‘ den sonra kaybetti. Bu nedenle, steroidogenesis beri ve özellikle de, estradiol üretim GC işlevlerin gerekli bir özelliktir, bu yönleriyle birincil hücre kültür modelleri incelemek için tavsiye edilir. Önceki çalışmalarda önemli estradiol üretim sadece serum serbest kültür koşulları8,9altında üremesini gösterilmiştir. GC başarısız olarak progesteron androstenedion10‘ a çevirmek için gerekli enzim ifade etmek daha fazla, estradiol sentez habercisi takviyesi başka bir, ön koşuldur. Ayrıca, FSH ve IGF-1 takviyesi vitro sinerjik etkisi aromataz, estradiol sentez11anahtar enzim en iyi duruma getirilmiş bir aktivite saptandı. Mevcut iletişim kuralında, GC kültür model üzerinde önemli bir etkiye sahip diğer önemli faktörler ayrıca açıklanmıştır. Özellikle, yoğunluk kaplama hücre12deneme sonucu üzerinde çok büyük etkileri vardır. Ayrıca, önemli ölçüde GC Fizyoloji kültür engel sığır GC dondurma tekniği oluşturulabilir. Bu teknik hücre kültür iş organizasyonu geliştirmeye ve tercih edilen kaplama yoğunluğu optimize etmek için yardımcı olur.
Sunulan hücre kültür modeli granulosa hücre farklılaşması içinde vitroanaliz etmek için bir araç sağlar. Çeşitli çalışmalarda serum-Alerjik ekimi kültürlü sığır GC veya diğer türler8,9GC steroid etkinliğini korumak için bir ön koşul olduğunu gösterdi. Ayrıca, hücre dışı matriks (Örneğin, kollajen R)13bileşenleri ile kültür çanak kaplama, ekin hücrelerin belirgin bir biçimde iyileştirilmiş. Bir diğer önemli özelliği uzun süreli kültür dönemdir. Son zamanlarda, uzun vadeli bir kültür yeterli steroidogenic etkinliği ve granulosa hücre kimlik işaretleri17dengeli bir ifade elde etmek gerekli olduğunu kanıtlanmıştır. Görünüşe göre GC yalıtım işlem sırasında fiziksel stresten kurtarmak için zaman gerektirir.
FSH, IGF-1 ve androstenedion aromataz etkinliğinde ikna etmek için bilinen medya takviyeleri GC kültürlü. Özellikle, ile androstenedion takviyesi kesinlikle gereklidir GC olarak bir habercisi estradiol sentezi için gerekir. Bu oldu daha önce11,18 yayınlandı ve bu nedenle, daha fazla çalışmanın sırasında soruşturma değil. Ancak, FSH, IGF-1 ve androstenedion konsantrasyonları bir uyarlaması deneysel diğer set-up için gerekli olabilir.
Burada açıklanan dondurma tekniği yanında yapım onları daha yumurtalık ile değişen kaynağından bağımsız doku kültürü deneyleri organizasyonu geliştirmeye yardımcı olabilir. Önceki test göre dondurma GC fenotip veya steroid kültür üretiminde etkilemez. Ayrıca, işaretleyici transkript kültürlü hücrelerdeki bereket önemli farklılıklar taze izole hücreler bu daha önce dondurma16için tabi ile hazırlanan örnekleri karşılaştırma olmadığını göstermiştir.
Mevcut GC kültür modeli için çok önemli bir parametre yoğunluğu kaplama hücredir. Temsilcisi sonuçlarıtarafından gösterildiği gibi kaplama yoğunluğu artan fizyolojik ve moleküler özellikleri dikkat çekici değişiklikler indüklenen. Çeşitli genler LH stimülasyon vivo içinde4,19tarafından indüklenir değişiklikleri benzeyen belirli bir şekilde düzenlenmiştir. Artan bir hücre yoğunluğu kültürlü sığır GC farklılaşma benzeri işlemler sürebilirim aslında titizlikle bu GC vitro modelde çoğaltır arasında çakışan sonuçları önlemek için dikkate alınması gereken vardır. Bu nedenle, diğer çalışmalar çelişkili sonuçlar için farklı hücre yoğunluğu atfedilen ve daha yakından incelenmesi gerekir.
Açıklanan kültür modeli algılama sınıra yakın reseptör LHCGR transkript bir çoğu burada ortaya LH için olmayan duyarlı olmak. Bu nedenle, hem LH dalgalanma bir simülasyon vivo içinde durum farklılaşma13ikna etmek başarısız oldu. Yine de, bu modeli estradiol aktif GC birincil kültür eğitim için yararlı bir araç sağlar, şu anda özellikle kadar hayır fonksiyonel sığır GC satır yok.
Farklı tedavi protokollerinin steroid üretim ya da GC farklılaşma düzenleyici mekanizmaları çözmeye yardımcı mevcut GC kültür modeli test edilebilir. Gelişim süreçlerinde söz konusu daha fazla, tek etkenler ayrı ayrı analiz edilebilir. Bu nedenle, bu kültür model birçok farklı uygulama için bir temel sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Biz Veronica Schreiter onun mükemmel teknik yardım ve kurulan dondurma tekniği ve hücre kültür modeli yararlı değişiklikler için teşekkür ederim. Ayrıca, biz gibi Maren Anders ve Swanhild Rodewald daha sonraki analiz onların mükemmel teknik yardım için teşekkür ederim.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |