सीरम मुक्त शर्तों के तहत गोजातीय granulosa कोशिकाओं का एक दीर्घकालिक संस्कृति मॉडल का वर्णन किया गया है । इस मॉडल के शोधकर्ताओं एस्ट्रोजन उत्पादन गोजातीय granulosa कोशिकाओं के लक्षण पर अलग चढ़ाना घनत्व के रूप में विविध कारकों और शर्तों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है ।
डिम्बग्रंथि granulosa कोशिकाएँ (GC) एस्ट्राडियोल संश्लेषण का प्रमुख स्रोत हैं. preovulatory luteinizing हार्मोन (LH) बढ़ने से प्रेरित, theca की कोशिकाओं और, विशेष रूप से, granulosa सेल परत के अपने रूपात्मक, शारीरिक, और आणविक विशेषताओं को बदलने के लिए और प्रोजेस्टेरोन निर्माण कोष के रूप में पिण्ड कि गर्भावस्था को बनाए रखने के लिए जिंमेदार है । कोशिका संस्कृति मॉडल folliculo-लुटियल परिवर्तन में शामिल अंतर्निहित विनियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए आवश्यक उपकरण हैं । प्रस्तुत प्रोटोकॉल छोटे-से मध्यम आकार के रोम (< 6 mm) से आइसोलेशन प्रक्रिया और गोजातीय GC की cryopreservation पर केंद्रित है । इस तकनीक के साथ, GC के एक लगभग शुद्ध आबादी प्राप्त किया जा सकता है । cryopreservation प्रक्रिया बहुत सेल संस्कृति एक प्रत्यक्ष प्राथमिक ऊतक (अंडाशय) की आपूर्ति के स्वतंत्र काम के समय प्रबंधन की सुविधा । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक सीरम मुक्त सेल संस्कृति मॉडल है कि एस्ट्राडियोल-गोजातीय जीसी के सक्रिय स्थिति की नकल । महत्वपूर्ण शर्तों है कि एक सफल स्टेरॉयड सक्रिय सेल संस्कृति के लिए आवश्यक है प्रोटोकॉल भर में चर्चा कर रहे हैं । यह प्रदर्शित किया जाता है कि कोशिकाओं के चढ़ाना घनत्व में वृद्धि एक बदल जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल और हार्मोन उत्पादन द्वारा संकेत के रूप में एक विशिष्ट प्रतिक्रिया लाती है । इसके अलावा, इस मॉडल GC भेदभाव और अंय अनुप्रयोगों पर आगे की पढ़ाई के लिए एक आधार प्रदान करता है ।
सफल ovulation और luteinization पतले देखते है और अच्छी तरह से अलग दैहिक तोंसिल्लितिस कोशिका प्रकार में आणविक परिवर्तन का उद्घोष पर निर्भर हैं । इन विकासात्मक प्रक्रियाओं के विवरण के बाद से अभी तक पूरी तरह से समझ नहीं है, आगे स्पष्टीकरण की आवश्यकता है । vivo दृष्टिकोण में व्यापक और महंगा है और विशेष रूप से, के लिए विशिष्ट आणविक तंत्र है कि folliculogenesis के दौरान होते है पता विफल । इसलिए, reductionistic इन विट्रो मॉडल में जरूरत के अलावा, सेलुलर और आणविक विवरण में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए कर रहे हैं । विभिंन अध्ययनों में पूरे रोम के संदर्भ में संस्कृति का वर्णन इन विट्रो निषेचन तकनीक1,2,3। क्योंकि शोधकर्ताओं भेदभाव के तंत्र में रुचि रखते हैं, कई अध्ययनों के लिए तोंसिल्लितिस पर ध्यान केंद्रित । इन कोशिकाओं, सीधे oocyte के साथ जुड़े, एस्ट्रोजन उत्पादन के प्रमुख स्रोत हैं और, इस प्रकार, folliculogenesis और luteinization4भर में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं ।
GC के अमर सेल लाइनों विभिन्न प्रजातियों से विकसित किया गया है. उनमें से अधिकांश, तथापि, एक पर्याप्त स्टेरॉयड हार्मोन उत्पादन5नहीं दिखा. अब तक, गोजातीय GC के केवल एक सेल लाइन6स्थापित किया गया है, लेकिन इस लाइन कई मार्ग7के बाद अपनी steroidogenic गतिविधि खो दिया है । इसलिए, steroidogenesis के बाद से और, विशेष रूप से, एस्ट्राडियोल उत्पादन GC कार्यशीलता का एक अनिवार्य सुविधा है, यह प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल में इन पहलुओं का अध्ययन करने के लिए सलाह दी जाती है । पिछले अध्ययनों में यह दर्शाया गया था कि एक काफी एस्ट्राडियोल उत्पादन केवल सीरम मुक्त संस्कृति शर्तों8,9के तहत मनाया जा सकता है । इसके अलावा पर, एस्ट्राडियोल संश्लेषण का एक अग्रदूत की पूरकता एक और शर्त है, के रूप में जीसी के लिए आवश्यक एंजाइम कि प्रोजेस्टेरोन androstenedione10में बदल सकते व्यक्त असफल । इसके अतिरिक्त, FSH और IGF-1 अनुपूरण के synergistic प्रभाव इन विट्रो में aromatase के एक अनुकूलित गतिविधि का पता चला, एस्ट्राडियोल संश्लेषण11की कुंजी एंजाइम. वर्तमान प्रोटोकॉल में GC कल्चर मॉडल पर काफी प्रभाव डालने वाले अन्य महत्वपूर्ण कारकों का भी वर्णन किया गया है । विशेष रूप से, सेल चढ़ाना घनत्व प्रयोग12के परिणाम पर जबरदस्त प्रभाव पड़ता है । इसके अलावा, गोजातीय gc के एक cryopreservation तकनीक है कि काफी संस्कृति में gc फिजियोलॉजी के साथ हस्तक्षेप नहीं स्थापित किया जा सकता है । इस तकनीक को सेल संस्कृति के काम के संगठन में सुधार करने के लिए और पसंदीदा चढ़ाना घनत्व का अनुकूलन में मदद करता है ।
प्रस्तुत सेल संस्कृति मॉडल एक उपकरण के लिए इन विट्रो मेंgranulosa सेल भेदभाव का विश्लेषण प्रदान करता है । कई अध्ययनों से पता चला है कि एक सीरम मुक्त खेती के लिए एक शर्त है कि कानूनी गोजातीय gc या अंय प्रजातियों8,9के जीसी में स्टेरॉयड गतिविधि बनाए रखने । इसके अतिरिक्त, extracellular मैट्रिक्स के घटकों के साथ संस्कृति पकवान कोटिंग (जैसे, कोलेजन आर)13, कोशिकाओं के लगाव काफी सुधार हुआ । एक अंय महत्वपूर्ण विशेषता लंबे समय तक संस्कृति अवधि है । हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया है कि एक दीर्घकालिक संस्कृति के लिए पर्याप्त steroidogenic गतिविधि और granulosa सेल पहचान मार्करों की एक संतुलित अभिव्यक्ति17प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । ऐसा लगता है कि GC अलगाव प्रक्रिया के दौरान शारीरिक तनाव से उबरने के लिए समय की आवश्यकता है ।
मीडिया की खुराक FSH, IGF-1, और androstenedione कल्चरल जीसी में aromatase गतिविधि पैदा करने के लिए जाना जाता है. विशेष रूप से, androstenedione के साथ पूरकता बिल्कुल आवश्यक है, के रूप में GC एस्ट्राडियोल संश्लेषण के लिए एक अग्रदूत की जरूरत है. यह पहले से प्रकाशित किया गया है11,18 और, इसलिए, आगे वर्तमान अध्ययन के दौरान जांच नहीं की गई । हालांकि, FSH के एक अनुकूलन, IGF-1, और androstenedione सांद्रता अन्य प्रयोगात्मक सेट अप के लिए आवश्यक हो सकता है.
यहां वर्णित cryopreservation तकनीक से अंडाशय के साथ बदलती आपूर्ति से उन्हें और स्वतंत्र बनाकर टिशू कल्चर प्रयोगों के संगठन को बेहतर बनाने में मदद मिल सकती है । पिछले परीक्षण के अनुसार, cryopreservation GC phenotype या स्टेरॉयड उत्पादन संस्कृति में प्रभावित नहीं करता है. इसके अलावा, प्रसंस्कृत कोशिकाओं में मार्कर टेप की बहुतायत महत्वपूर्ण पहले cryopreservation16के अधीन उन लोगों के साथ हौसले से पृथक कोशिकाओं से तैयार नमूनों की तुलना अंतर प्रकट नहीं किया ।
वर्तमान जीसी संस्कृति मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर कोशिका चढ़ाना घनत्व है । के रूप में प्रतिनिधि परिणामद्वारा दिखाया गया है, चढ़ाना घनत्व बढ़ाने शारीरिक और आणविक विशेषताओं के उल्लेखनीय परिवर्तन प्रेरित किया । कई जीन एक विशिष्ट तरीके से विनियमित रहे हैं, परिवर्तन है कि vivo4,19में LH उत्तेजना द्वारा प्रेरित कर रहे है जैसी । तथ्य यह है कि एक बढ़ती सेल घनत्व भेदभाव ड्राइव कर सकते है संस्कृति गोजातीय gc में प्रक्रियाओं की तरह है सावधानी से इस में GC में विचार किया जाना है इन विट्रो मॉडल के बीच परस्पर विरोधी परिणामों से बचने के लिए दोहराने । इसलिए, अंय अध्ययनों के साथ विरोधाभासी परिणाम अलग सेल घनत्व के लिए जिंमेदार माना हो सकता है और अधिक बारीकी से जांच की जानी चाहिए ।
संस्कृति मॉडल यहां वर्णित गैर को LH के लिए उत्तरदाई हो, रिसेप्टर LHCGR के टेप के रूप में पता लगाने की सीमा के करीब हैं । इसलिए, एक जैसे LH वृद्धि का अनुकरण vivo स्थिति में 13विभेद पैदा करने में विफल रहा है । बहरहाल, इस मॉडल को एक उपयोगी उपकरण के लिए प्राथमिक संस्कृति में एस्ट्राडियोल-सक्रिय gc, विशेष रूप से कोई कार्यात्मक गोजातीय gc लाइनों वर्तमान में मौजूद के रूप में अध्ययन प्रदान करता है ।
विभिंन उपचार प्रोटोकॉल वर्तमान gc संस्कृति मॉडल है कि स्टेरॉयड उत्पादन या जीसी भेदभाव के विनियामक तंत्र को जानने में मदद में परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, एक कारक है कि विकास प्रक्रियाओं में शामिल कर रहे है अलग से विश्लेषण किया जा सकता है । इसलिए, इस संस्कृति मॉडल कई विभिंन अनुप्रयोगों के लिए एक आधार प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और स्थापित cryopreservation तकनीक और सेल संस्कृति मॉडल के सहायक संशोधनों के लिए वेरोनिका Schreiter धंयवाद । इसके अतिरिक्त, हम बाद में विश्लेषण में उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मरेन ऐंडर्स और Swanhild Rodewald शुक्रिया अदा करना पसंद करते हैं ।
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |