乙型肝炎体外感染形成的低拷贝数综合病毒 dna 的检测

1. 细胞感染与 dna 提取 在 dulbecco 的改良鹰培养基 (dmem) 中保持培养 huh7-ntcp 细胞 8, 9, 辅以10% 的 v/v 胎儿牛血清、1x penicilin\ 链霉素和 2 mm l-谷氨酰胺。注: 这已详细报告40。 种子 2 x10 5细胞/huh7-ntcp 细胞到一个12孔板与1毫升的 dmem。 如果检测细胞治疗 (例如,乙肝病毒抑制剂), 将其应用于播种后 4小时 (乙肝病毒感染前 1天) 的培养上清液。对于阴性对照, 应用 200 nm myrcludex b (一种有效的 hbv 进入抑制剂 41)。 使用肝素柱纯化 42上清液从汉法 38 43 作为接种剂, 在500μl 培养基中感染 1, 000 v/v 细胞的细胞 (dmem 补充 10% v/v 胎牛血清、1x Penicillin/Streptomycin、2 mm l-谷氨酰胺和 2.5% vv)dmso), 含有 4% wl w/聚乙二醇 8000 [溶于1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs)]。 在37°c 的孵化器中培养细胞 (设置为 5% co2和90% 湿度)。 在感染后16-24小时用1毫升的无菌 1x pbs 清洗细胞。 在感染乙肝病毒后每2天更换一次培养基, 直至收获。 在感染后第3天, 用 5μm tenofovir diso抵抗勒和 10μm lamivudine 对细胞进行治疗, 以限制 hbv 复制中间体的生产, 这些中间体可通过 invpcr 扩增。 在感染后第5天, 用200μl 的胰蛋白酶-edta 对细胞进行胰蛋白酶化, 并在2毫升的 dmem 中重新悬浮细胞 (辅以 10% vw. v. 胎牛血清, 1x penicilin\ 链霉素和 2mm l-谷氨酰胺), 还含有5μm 替诺福韦二氧基和10μm拉米夫 定。 将细胞悬浮液转移到6孔板, 以诱导一轮有丝分裂 (据报道, 有丝分裂会导致 hbv cccdna 44 和其他 hbv dna 中间体的丢失, 可通过 invcr 扩增). 在感染后第7天, 在400微米-edta 中对膨胀细胞进行胰蛋白酶化, 并在 dmem 的1毫升中重新悬浮混合物。将悬浮液放入 1.5 ml 管中, 以 500 x g 离心5分钟的离心将细胞颗粒, 并通过吸入去除上清液。 (可选)将细胞颗粒存放在-20°c, 直到它们准备好进行 dna 提取。 根据制造商的说明, 使用 dna 提取试剂盒从细胞颗粒中提取 dna。使用光学密度测量估计最终的 dna 浓度。注: 100μl 洗脱体积的 dna 收率一般为 ~ 250-400 ngμl。 2. dna 的反转 从步骤1到 200μl pcr 管的总 dna 提取物中, 有一个倾斜的 ~ 1.5-2.5 微克。添加适当数量的限制性酶母细胞混合, 形成含有1x 消化反应缓冲液 (例如, cut智能缓冲液) 和 10 u ncoi-hf 的40μl 反应体积. 将反应彻底混合, 在一个小管离心机中旋转下来。在37°c 的 pcr 机器中培养限制性酶反应 1小时, 以获得最佳的消化效率。 在80°c 孵育 20分钟, 使限制性酶失活。 将整个限制性酶反应转移到 1.5 ml 管。加入400μl 的 1x t4 dna 连接酶缓冲液和 500 u t4 dna 连接酶, 并将其彻底混合。大的反应量鼓励被消化的 dna 片段的分子内 (而不是分子间) 结扎。 在室温下培养结扎反应 2小时, 确保完全结扎。 在70°c 下失活 t4 dna 连接酶20分钟。 加入10μl 的 10% w/v 十二烷基硫酸钠, 以确保 t4 连接酶完全失活。 通过脉冲涡流混合管, 并短暂旋转下反应混合物。将氯化钠添加到 100 mm 的最终浓度和90% 的浓度 (35–45 kda) 中, 最终浓度为90μgml。通过脉冲涡流混合管, 并短暂旋转下反应混合物。 加入900μl 的100% 乙醇, 通过倒置搅拌。在-20°c 下一夜沉淀 dna。 用 14, 000 x g 离心沉淀 dna 15分钟, 用 p200 移液器抽吸去除上清液。用500μl 的 70% v/v 乙醇清洗颗粒, 并在 14, 000 x 克离心15分钟。 用 p200 移液器抽吸乙醇。在室温下将 dna 颗粒风干20分钟。 溶解在20μl 的 h2o. 加入20μl 的限制性酶母料混合物, 产生40μl 反应体积, 其中含有1x 消化反应缓冲液、 5 u 的 bsihkai 和5 u 的 sphi-hf 反应. 将限制性酶反应注入在 37°c ( sphi-hf 的最佳温度) 下热块1小时。 简单地旋转下反应混合物。在 65°c ( bsihkai 的最佳温度) 下, 在热块中培养限制性酶反应1小时。 简单地旋转下反应混合物。 将倒置的 dna 存储在-20°c, 直到下一步。 3. 嵌套 pcr 使用 dna 降解溶液从可重复使用的硅垫密封中取出潜在的放大器, 用无 dna 的水彻底冲洗垫子, 并在室温下进行空气干燥, 同时制备 pcr 混合物。 制备1毫升的 1x pcr 混合物, 其中包含外部正向 (5 ‘-ttc gct cct ctg cctg cac g-3 ‘) 和反向 (5 ‘-aaa gga cgt cccg ccg cg cg-3 ‘) 的外正向 (5 ‘—一度 cca ctg g-3 ‘), 浓度为0.5μm。 在96孔 pcr 板的 a1 和 e1 井中加入1xpcr 混合物的170μl。 在 b1 至 h1 井中加入1xpcr 混合物的120μl。 将步骤2中的倒置 dna 添加10μl 到 a1 井和 e1 井 (可在同一 pcr 板上分析2个不同的倒置样品)。使用 p1000 设置为 100μl, 每口轻轻移液 10次, 将反应混合在每口井中。 通过在每一步传输 60μl, 以1:3 的比例从 a1 到 d1 进行串行稀释样品。在每一步使用 p1000 设置为100μl 的 p1000 轻轻移液约 10次, 将井混合在一起。避免形成气泡。对油井 e1 重复步骤 3.6, 向下稀释至井 h1。 在96孔板中, 用多通道移液器将反应混合物从 a1-h1 输送到 a2-h2、a3-h3 等井, 直到到达 a12-h12 井。用步骤3.1 中的干硅垫覆盖 pcr 板, 用力按压。 将板材放入 pcr 机器中, 运行以下程序: 95°c 时 10分钟;95°c 时的周期为 15秒, 54°c 时为 15秒, 72°c 时周期为 3分钟;72°c 时 7分钟;然后, 在室温下按住盘子。 用本森燃烧器将96针复制器的针脚加热到红热, 然后在室温下冷却至少5分钟。 用10μl 的 1x pcr 混合物 (含凝胶负载就绪缓冲液) 和内部正向 (5 ‘-cgc atg acc gtg gtg a-3 ‘) 和反向 (5 ‘-cac agc gcda gcda gcda gcc aggcg g-3 ‘) 在0.5μm 处填充第二片 pcr 板的井。 从第一轮 pcr 中小心地从96孔板的 pcr 板上取出硅垫, 避免井间交叉污染。 利用冷却复制器将96孔板的 pcr 产物从第一轮 pcr 转移到新引用的96孔板。使用与步骤3.8 相同的条件进行嵌套 pcr, 但在95°c 时将初始变性步骤从10分钟更改为2分钟除外。 4. pcr 产品分离与凝胶提取 用1.3% 的琼脂糖凝胶96孔对凝胶电泳技术分析了 pcr 产物。对于100毫升琼脂糖凝胶, 以 200 v 的速度运行10-15分钟。 使用一次性饮用吸管对琼脂糖凝胶的 dna 带进行消费。对于每个 pcr 产品, 将秸秆和琼脂糖凝胶塞放入 1.5 ml 管中, 并用剪刀修剪秸秆以使其大小。注: 仅从可以解析单个 pcr 产品的稀释中分离带就足够了。 (可选)将管材存放在-20°C, 供以后提取。 通过挤压秸秆碎片的末端, 将琼脂糖塞喷射到每个管中。在每个管中加入300μl 的凝胶萃取缓冲液和5μl 的凝胶萃取玻璃珠浆料。 按照制造商关于凝胶提取试剂盒的说明提取 pcr 产品 (使用半卷清洗步骤除外), 并用30μl 的水从珠子中提取 dna。 提交纯化的 dna 进行 sanger 测序 (按照供应商的说明) 与第二轮嵌套 pcr 中使用的正向引物。 5. 序列分析 通过执行核苷酸 blast 分析 (使用与整个核苷酸集合对齐的默认设置) 确认病毒细胞 dna 连接点。注: 以下图3详细介绍了代表性结果。 如果只观察到序列的部分对齐, 请先修剪 5 ‘ hbv dna 序列, 然后再重新进行 blast 分析。 应用严格的选择标准来确定给定序列是否表示真正的集成连接点, 如下所示: 只包括含有 & gt;20 bp 的细胞序列的序列, 以便自信地映射到细胞基因组。 忽略任何序列, 其中包含在假定的病毒细胞整合连接点的 10 bp 内使用的任何酶的限制位点, 因为它们可能代表体外结扎事件, 而不是真正的整合连接点。 在测序色谱中, 忽略假定积分结两侧的任何峰值荧光水平明显不同的序列, 因为这些序列化可能是测序反应过程中交叉污染产生的伪影, 或者毛细管色谱。 定义独特的整合事件, 因为那些与确切的乙肝病毒和细胞序列在病毒细胞交界处。注: 重复独特的积分事件可能是由于 pcr 过程中含有这些积分或交叉污染的细胞的克隆扩张 (可以使用负对照反应进行测试, 在具有代表性的结果中进一步详细说明))。由于使用非同源端接路径, 预计将与特定细胞序列重复集成, 并为每个集成事件显示不同的 hbv 终端位点,因为使用了15个非同源端接路径。 通过将倒置 dna 模板的稀释因子乘以在该稀释时检测到的病毒细胞连接点的数量来计算积分频率, 然后将 dna 输入量归一化到反演反应中。一般情况下, 积分频率约为 1:104 个单元。