يصف لنا هنا الجيل في المختبر للحمض النووي HBV عبر نظام عدوى بفيروس التهاب الكبد البائي والكشف عن درجة عالية من الحساسية للتكامل (1 – 2 نسخة) استخدام معكوس متداخلة PCR.
فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو مشتركة الممرضات المنقولة بالدم تسبب سرطان الكبد وتليف الكبد الناجمة عن العدوى المزمنة. الفيروس يتطابق عموما من خلال الحمض النووي ابيسومال متوسطة؛ ومع ذلك، إدماج شظايا من الحمض النووي HBV في جينوم مضيف وقد لوحظ، على الرغم من أن هذا النموذج ليس ضروريا للنسخ المتماثل الفيروسية. الهدف المحدد، وتوقيت، والآليات بالحمض النووي HBV الذي يحدث التكامل لم تظهر البيانات واضحة، ولكن مؤخرا أنه يحدث في وقت مبكر جداً بعد الإصابة. هنا، في المختبر توليد والكشف عن الحمض النووي HBV التكاملات موصوفة بالتفصيل. لدينا بروتوكول على وجه التحديد يستفيض نسخة واحدة من خلايا الفيروس الحمض النووي التكاملات ويسمح الكمي المطلق والقرار زوج واحد-قاعدة تسلسل مفرق. طبق هذا الأسلوب على مختلف أنواع الخلايا HBV-عرضه (بما في ذلك خلايا الكبد البشري الأساسي)، إلى مختلف HBV طفرات، وبالاقتران مع مختلف المخدرات التعرض. ونتوقع هذه التقنية أصبح مقايسة مفتاح تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الظاهرة ذات الصلة سريرياً.
HBV هو فيروس الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي يمكن أن تسبب العدوى المزمنة مدى الحياة، مما يؤدي إلى تليف الكبد وسرطانه الخلية الكبدية (HCC)1،،من23. وفي حين توجد عدة آليات الجزيئية القيادة HBV استمرار4 (مثلاً، ارتفاع ثبات القالب النسخي جينية فيروسية)، وتهرب مراقبة المناعية، وانخفاض معدل الدوران لخلايا الكبد في الكبد وما يرتبط بها مخاطر العقود بدء5،6 (مثل التهاب مزمن وتفعيل الخلوية التشديد على مسارات)، تم درس إدماج الحمض النووي HBV في جينوم الخلية المضيفة (إليه المبلغ عنها لكل من هذه الظواهر) ضعيف . سبب رئيسي هو عدم مناسبة في المختبر العدوى نظم HBV التي تتيح كشف يعول عليها لإحداث التكامل. هنا، نحن وصف بروتوكول وضعت مؤخرا لكل جيل في المختبر والكشف عن الحمض النووي HBV التكاملات التي يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة والآثار المترتبة عليها.
واستعرضت HBV النسخ المتماثل وتشكيل الحمض النووي HBV التكامل سابقا بالتفصيل7. بإيجاز، يدخل HBV خلايا الكبد باستخدام الصوديوم توروتشولاتي كوترانسبورتينج الببتيد (نتكب) مستقبلات الخلوية الرئيسية للعدوى8،9. نوكليوكابسيدس HBV المحتوية على استرخاء HBV التعميم الحمض النووي (ركدنا) يدخل الجينوم النواة، حيث ركدنا يتم تحويلها إلى الحمض النووي دائرية مغلقة تساهمي ابيسومال (كككدنا). كككدنا النووية بمثابة قالب النسخي مرناس الفيروسية وقبل المجينية الحمض النووي الريبي (بجرنا)10. ثم يتم حزم بوليميريز HBV وبجرنا في نوكليوكابسيدس المشكلة حديثا (التي تتألف من dimers البروتين الأساسية HBV). بجرنا HBV عكس نسخها داخل نوكليوكابسيد، مما أدى إلى أما جينوم ركدنا أو مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل خطي الحمض النووي (دسلدنا) جينوم11،12. وأخيراً هذه نوكليوكابسيدس الناضجة تحتوي على مورثات الحمض النووي HBV يلفها وتصديرها فيريونس.
يمكن أن تؤدي العدوى من خلايا الكبد بجسيمات المغلفة التي تحتوي على جزيئات دسلدنا الفيروسية إدماج المضيف الخلية الجينوم13، مما أدى إلى أشكال غير كفء النسخ المتماثل من الحمض النووي HBV7،،من1415. يحدث التكامل الحمض النووي HBV في موقع الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الصبغية فواصل15. تتراكم الأدلة تشير إلى أن يحدث كل حدث التكامل في وضع أساسا عشوائية داخل الخلية المضيفة الجينوم16،17. وبالإضافة إلى ذلك، يحدث التكامل الحمض النووي HBV نوعا ما إلا نادراً، بمعدل 1 من كل 104 خلايا13،18،،من1920. أسئلة هامة فيما يتعلق بإدماج الحمض النووي HBV لا تزال دون إجابة، لا سيما فيما يتعلق بالمسارات الجزيئية الدقيقة المعنية، الاعتماد على الفيروسية وعوامل المضيف، مولدات المضادات الفيروسية أعرب من النماذج المتكاملة، ومساهمتها المحتملة لاستمرار الفيروسية7. أنشأنا نموذجا في المختبر لتسليط الضوء على بعض هذه الأسئلة.
ندرة أحداث التكامل الحمض النووي HBV (سواء فيما يتعلق بمعدل إدماج كل خلية وعدد النسخ من كل تكامل فريد) في الإصابة في المختبر HBV نماذج جعل لهم تحديا للكشف. الانقسام الخلية محدودة في نظامنا في المختبر ، كما لا تدعم تقسيم الخلايا العدوى بكفاءة. وهكذا، خلافا في أنسجة الكبد المريض حيث يحدث توسع كبير الاستنساخ من خلايا الكبد1918،،20، جداً قليلة (1 إلى 2) نسخ من كل التكامل موجودة في مجمع معين من الخلايا المصابة في المختبر . وقد وجدنا أيضا أن التكامل يحدث أساسا أثناء الإصابة الأولى لخلايا الكبد (وليس بشكل مستمر في خلايا الكبد المصابين بأمراض مزمنة)13. تبعاً لذلك، لا يمكن زيادة التكامل الحمض النووي HBV ببساطة استزراع الخلايا لفترة أطول.
وبصفة عامة، الأساليب المستخدمة سابقا للكشف عن الحمض النووي HBV المتكاملة، بما في ذلك جنوب لطخة التهجين21،،من2223،24،25، الو-بكر26،27 ، كاسيت بوساطة ربط PCR28، والجينوم كله التسلسل29،،من3031،،من3233، لم يكن لديك حساسية للكشف عن نسخ واحدة من التكامل. ونحن وغيرهم من الباحثين استخدموا معكوس متداخلة بكر (إينفبكر) للكشف عن تكامل الحمض النووي هيبادنافيرال في داك ووودكوك الاكباد المصابة البشرية13،14،،من1819، 35،،من 3436. أخرى أدخلت التعديلات الإجرائية إلى تقنية إينفبكر التي قد يغير توليد إشارات إيجابية كاذبة وتقييد القدرة على القياس الكمي37. إذا نفذ الفحص كما هو موضح في هذا البروتوكول، يمثل إينفبكر مقايسة الخاصة والحساسة التي تحدد ويوضحها (بالأرقام المطلقة نسخة) متعددة الحمض النووي HBV التكاملات. يتم تعيين تسلسل الحمض النووي HBV-خلية التقاطع بدقة زوج قاعدة واحدة، السماح للدراسات بيوينفورماتيكال من الفيروسية وتسلسل الحمض النووي المضيفة في مواقع التكامل13.
التي وصفناها سابقا نتائج38 من إينفبكر في الأنسجة المصابة بالحمض النووي HBV المستخرجة من مجموعة كبيرة من المصادر، بما في ذلك أنسجة الكبد مجمدة في الأداة الإضافية وجزءاً لا يتجزأ من البارافين أقسام الكبد وعينات الأنسجة الصغيرة للغاية تم عزلة بواسطة الليزر-ميكروديسيكتيون19. ويحدد هذا البروتوكول إصدار محدث من الإنزيم إينفبكر استخدام الحمض النووي المستخرج من الخلية المستمدة من الثقافة الأنسجة بعد الإصابة في المختبر ، التي يتم إنشاؤها بإعداد نسخة منخفضة من التكاملات (1 – 2 نسخ كل التكامل). الحمض النووي HBV التكاملات شكلت في المختبر تشبه تلك الموجودة في أنسجة المريض فيما يتعلق بتوزيعها على الجينوم الخلوي وتقاطع داخل التسلسل الفيروسي هو متكامل13،16، مما يوحي الطريق قابلة للمقارنة إلى داخل كبد المصابين.
قبل تنفيذ البروتوكول، من المهم أن نلاحظ أن هذا الإنزيم إينفبكر تقنية عالية حساسية، قادرة على تضخيم نسخة واحدة من قالب الحمض النووي. ولذلك، الحد من التلوث الناجم عن منتجات PCR ذات أهمية قصوى. فيما يلي الاستراتيجيات العامة للحد من تلوث المنتج PCR. (ط) إنشاء مناطق منفصلة فعلياً للخطوات المختلفة للأسلوب. ينبغي أن يكون لكل مجال المعاطف مختبر منفصلة، ويجب تغيير القفازات عند التنقل بين هذه المناطق. لدينا سرد هذه المجالات أدناه بالترتيب من معظم إلى الأقل احتمالاً تكون ملوثة: بكر الاستخراج وتتابع رد فعل إنشاء منطقة المنتج (وظيفة-PCR)؛ إضافة قالب بكر ودبوس ملتهب نقل المنطقة (وقد استخدمنا أغطية PCR مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية ديكونتاميناتينج مع نتائج جيدة)؛ منطقة الاستخراج وانعكاس الحمض النووي (ما قبل-PCR)؛ ومنطقة “الحمض النووي خال من قالب” تستخدم فقط لإعداد الأوراق المالية وحلول PCR. (ثانيا) أن يكون علم بتدفق الهواء في المختبر كسائق محتملة للتلوث عبر. على وجه الخصوص، التلوث عبر ردود الفعل بكر أثناء الخطوة نقل دبوس ملتهب الأكثر احتمالاً أن يحدث، وسوف يؤدي إلى التقدير الكمي غير دقيقة لوتيرة التكامل. يمكن استخدام أغطية PCR للحد من هذه التيارات العابرة. آبار المراقبة السلبية (مثلاً عينات تعامل ب ميركلوديكس أو أية عناصر تحكم قالب) في ال [بكر] يمكن استخدامها أيضا لاختبار للتلوث عبر. (ثالثا) الحد من الملوثات المحتملة بكر على الماصات وأسطح العمل بانتظام مسح أسفل مع حل تدهور الحمض النووي.
يتم ترتيب البروتوكول المحدد هنا للكشف عن تكامل استنساخ HBV المعدية المعروفة التي تم إنشاؤها من خط خلية HepAD3842. إذا كانت العدوى استخدام تسلسل الحمض النووي HBV مختلفة (مثلاً، من مصل المريض)، ثم الجينوم HBV ينبغي أن تكون أول متسلسلة لتأكيد التوافق [بكر] كبسولة تفجير وتصميم انعكاس. في19من الدراسات المنشورة سابقا، فقد استخدمنا 3 مجموعات من الإشعال التي تربط المصانة تسلسل الحمض النووي HBV المرافقة الموقع المتوقع للحمض النووي HBV تكامل الوصلات. تسلسلات التمهيدي والبروتوكولات الأخرى قد ورد وصف لتحديد تسلسل الجينوم HBV44،،من4546،،من4748 وقد تعمل بنجاح.
وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام خلايا HBV-عرضه مختلفة (مثلاً خلايا الكبد البشرية الأساسية، هيبرج المتباينة، HepG2-نتكب الخلايا)؛ ومع ذلك، وجدنا أن الخلايا Huh7-نتكب توفير أكبر نسبة الإشارة إلى الضجيج، عند النظر في عدد خلايا الفيروس الحمض النووي الوصلات التي تزداد مقارنة بفيروس الحمض النووي الوسيطة التي يتم تضخيم13. على وجه الخصوص، لا تخضع الخلايا المتمايزة لا شفاء منها مثل خلايا الكبد البشرية الأولية أو هيبرج المتباينة كفاءة الانقسام، أدى إلى ارتفاع مستوى الحمض النووي HBV أمبليفيابل وسيطة replicative المتبقية داخل الخلايا. وقد وجدنا أن ~ 90% تسلسلات تضخيم تمثيل الحمض النووي HBV ترتيبات جديدة (وعدم إدماج الأحداث) في الخلايا المتمايزة لا شفاء منها، مقارنة مع 70-50% في خطوط الخلايا الكبدي13. هذه المنتجات عموما جينوم الحمض النووي HBV المحتوية على الحذف الكبيرة في المياه السطحية والأساسية قراءة الإطارات المفتوحة، أو أنها يمكن أن تمثل الأنواع شبه HBV مع إضافية ضابط صفأنا الموقع قبل Sphأنا الموقع. التضخيم من هذه الأنواع HBV (بما في ذلك الرسم تخطيطي) قد وصفت بالتفصيل سابقا13.
وهناك عدة عيوب لهذا الأسلوب. نظراً لطبيعة شاقة ومتعددة اليوم من هذا البروتوكول، لا تتناسب مع إينفبكر إلى تحليلات الفائق لعدد كبير من العينات. وعلاوة على ذلك، كما أنها تعتمد على الحد من معايرة تمييع، أسلوبنا ليس درجة عالية من الدقة في التحديد الكمي؛ وعلى الرغم من أنه ينبغي قياس بسهولة تغيير مستوى سجل في وتيرة التكامل.
وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول انعكاس فقط مناسب للكشف عن التكاملات التي تقع بين منطقة DR2 و DR1 الجينوم HBV، كما تحدث غالبية HBV التكامل داخل هذه المنطقة49. خ ع تحليل HBV أنسجة المريض قد أظهرت أن أقلية كبيرة (تصل إلى ~ 50 ٪) قد تحدث أيضا خارج هذه المنطقة49. تصاميم إينفبكر جديدة نظرياً قادراً على الكشف عن هذه المواقع التكامل الأخرى، على الرغم من أنهم لا (على حد علمنا) قد نفذت حتى الآن. فائدتين، بسبب المواقع إنزيم التقييد اللازمة المطلوبة المصب من تسلسل الفيروس–خلية تقاطع لرد فعل انعكاس، إينفبكر لم يكشف جميع التكاملات التي تقع داخل مناطق الجينوم HBV DR2 و DR1 (أي، نحن ويقدر أن ~ 10% من جميع التكاملات قابلة للاكتشاف باستخدام المحاكاة في السيليكون 13). ومع ذلك، عند تطبيق مجموعة مركزة من العينات مع عدد قليل من العلاجات المختلفة، إينفبكر واحدة من طرق العملي الوحيد للكشف عن الحمض النووي HBV المتكاملة في قرار واحد لزوج قاعدي.
ونحن نتصور ذلك تطبيقات هذا الأسلوب يخدم دوراً رئيسيا في إيجاد الفيروسية (عن طريق طفرات العدوى HBV)، الخلوي (عن طريق خروج المغلوب أو overexpression من الجينات الخلوية محددة، أو من خلال تطبيق مختلف العقاقير)، والبيئة ( مثلاً، التعرض للأكسدة) العوامل التي تحفز الحمض النووي HBV التكامل. مع هذا الأسلوب ونظم العدوى HBV المطورة حديثا، ونحن تمكين التحكم لم يسبق لها مثيل لهذه العوامل حتى يمكن أن تكون معزولة جيدا واتسمت أفضل. ونتوقع أيضا أن هذا سيؤدي إلى فهم رئيسية لعواقب الخلوية للحمض النووي HBV التكامل، بما في ذلك ما مدى المضادات الفيروسية (مثلاً، HBx أو HBsAg50) يتم التعبير عنها من خلال نموذج متكامل، ما هي الضوابط هذا التعبير، وأم لا يتغير HBV التكامل إلى حد كبير النمط الظاهري الخلوية تجاه دولة برو-النمطان أكثر. نتائج هذه الدراسات في المستقبل سيكون لها أثر عميق على الاستراتيجيات العلاجية المستخدمة لعلاج التهاب الكبد المزمن وعلى الفهم الأساسي للفيروس نفسه.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل وتلقى تمويل من “المركز الألماني” للبحوث العدوى (دزيف) ووحدة تعقب المعاملات التهاب الكبد مشاريع 5.807 5.704، TRR179 الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) (ن 15)، و “المركز الأسترالي” لبحوث علم الفيروسات التهاب الكبد وفيروس نقص المناعة البشرية.
نحن مدينون للبروفسور وليام ماسون من جانبه في تطوير طريقة إينفبكر الأصلية، ومما يدل على أنه بالنسبة لنا. نود أن نشكر الدكتور يي ني وفلوريان ألف ليمب على الكواشف (خطوط الخلايا والعدوى HBV). نحن نسلم Rippert إنجا، [فرنزيسكا Schlund، انجيلهاردت سارة، والدكتورة كاترين Schöneweis للمساعدة التقنية. ونحن ممتنون ميريام كلينيج لتصحيح التجارب المطبعية، والأساتذة نيكولاس شاكيل ورالف بارتينشلاجير للدعم المستمر.
Dulbecco’s PBS | PAA | H15-002 | |
DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 41965 | |
Fetal bovine serum | PAA | A15-151 | Heat-inactivate before use |
Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100× | PAA | P11-010 | |
L-glutamine, 200mM | PAA | M11-004 | |
Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1× | PAA | L11-004 | |
PEG, MW 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use |
DMSO for spectroscopy | Merck | 102950 | |
Tenofovir disoproxil | Sigma-Aldrich | CDS021622 | Dissolve in DMSO |
Lamivudine | Sigma-Aldrich | L1295 | Dissolve in DMSO |
NucleoSpin Tissue kit | Macherey Nagel | 740952.250 | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
NcoI-HF | NEB | R3193L | |
T4 DNA ligase | NEB | M0202T | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 433209 | |
Dextran (35 -45 kDa) | Sigma-Aldrich | D1662-10G | |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 32205-1L-D | |
BsiHKAI | NEB | R0570L | |
SphI-HF | NEB | R3182L | |
Amplitaq Gold Taq kit | Thermo Fisher Scientific | 4331816 | Use for first nest PCR |
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates | Biorad | 2239442 | |
DNAZap PCR DNA Degradation Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9890 | |
96-well PCR plates | Sigma Aldrich | CLS6509 SIGMA | |
96-pin replicator | Thermo Fisher Scientific | 250520 | |
GoTaq Flexi PCR kit | Promega | M8295 | Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel |
Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
QIAEX II Gel extraction kit | QIAGEN | 20051 |