יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

1. הכנת Cas9/gRNA ביטוי ובונה התורם בנייה של פלסמידים ביטוי Cas9/gRNA עיצוב רצף gRNA מיקוד intergenic אזור בין הגנים UL45 ו- UL46 של HVT כפי שתואר לעיל22. יישר את רצף המטרה מדריך-RNA כנגד הגנום HVT כדי לשלול כל רצפי חופש-יעד פוטנציאליים הגנום HVT. לסנתז, לשכפל את רצף gRNA פילוח אזור UL45/46 ו- sg-A רצף של נתונים שפורסמו23 לתוך pX459-V2 כפי שתואר לעיל22. ודא את רצף gRNA המשוכפל מאת סנגר רצף באמצעות פריימר U6-Fwd24. בנייה של התורם פלסמיד כדי ליצור של התורם פלסמיד המכיל את הקלטת VP2 ביטוי מתויג עם קלטת כתב GFP נשלף, עיצוב oligos התורם-F ותורם-R המכיל את הרכיבים הבאים (איור 1א’ ואיור 3א): sg-A רצף המטרה-מסתיים, אתר פאצי תמר מוקף עם שני רצפים LoxP שכפול ה-קלטת כתב ה-GFP, כריתה, והן בשני אתרים SfiI עבור השיבוט בקלטת ביטוי VP2. לשכפל את הרצף לתוך וקטור pGEM-T-קל ו, אז, שיבוט הקלטות גן ה-GFP, VP2 לתוך הווקטור שנוצר כדי להפיק את פלסמיד התורם כמנהל pGEM-מועצת התלמידים-GFP-VP222.הערה: כל וקטור השיבוט יכול לשמש כדי לבנות התורם פלסמיד. פלסמיד DNA הכנה להכין פלסמיד התורם והן פלסמיד ביטוי Cas9/gRNA DNAs באמצעות ערכת חילוץ DNA מסחרי על פי הוראות היצרן. 2. CRISPR/Cas9-מתווכת טוק-in: תקנים ולדלקת יום לפני תרביות תאים, להכין חומוס העובר fibroblasts (CEFs) תרביות תאים/הזיהום, באמצעות עוברי 10 – בן יום M199 בינוני בתוספת 5% סרום שור עוברית (FBS), 10% tryptose פוספט מרק, פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין, ו fungizone 0.25 µg/mL. זרע 1.3 x 106 תאים לכל לחדר כל טוב של צלחת 6-ובכן ב- 2.5 מ של מדיום.הערה: תאים CEF יכול להישמר עבור 3 d-4 מעלות צלזיוס. Transfect CEF תאים (שלב מוכן ב 2.1) עם 0.5 µg של UL45/46-gRNA, 0.5 µg של sg 1 µg של pGEM-מועצת התלמידים-GFP-VP2 באמצעות ריאגנט של תרביות תאים המתאימים על פי הוראות היצרן. דגירה התאים במשך 12 שעות בתוך אינקובטור (ב- 38.5 ° C עם 5% CO2). 12 שעות posttransfection של Cas9/gRNA, התורם פלסמידים, לדלל את המניה וירוס HVT M199 תרבות בינונית-עונה 1 פרק 105 pfu/מ ל…. הוסף µL 130 של הנגיף מדולל לבאר כל התאים transfected והגדר באר אחת של תאים untransfected כפקד שלילי עם אותה כמות. של וירוס. דגירה את התאים transfected/נגוע עבור בתלת-ממד ב- 38.5 ° C עם 5% CO2. לבצע את כל ההליכים שימוש משותף קוד של המנהג (JCoPR) אושרה על ידי התורמים שחיים. 3. קצירת טיהור של וירוס רקומביננטי HVT תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון להכין שתי צלחות 96-ובכן preseeded עם 2 x 104 תאים CEF ליום טוב לפני מיון. Trypsinize transfected/נגוע postinfection-d CEFs 3. האחות המדיום מכל קידוח ולשטוף את הגיליון תא בתמיסת באגירה פוספט (PBS). להוסיף 1 מ”ל של 0.05% טריפסין-EDTA (0.48 מ”מ) כדי trypsinize את התאים בחממה 38.5 מעלות צלזיוס במשך כ 5 דקות. Resuspend ולהעביר את התאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL עם 50 µL של FBS. צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות. Resuspend תאי 1 מ”ל של PBS עם 1% FBS. לספור את מספרי הטלפון הנייד באמצעות hemocytometer ולהתאים את מספר התאים עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל….הערה: תאים ניתן לשמור על הקרח עבור h 1-2. העבר את התאים פוליסטירן מיון הצינורית בתוך כובע מסננת שלה. למיין את התאים לבטא GFP 96-ובכן לוחות עם CEFs שימוש בסדרן תא על-פי הוראות היצרן. דגירה את התאים מיון עבור 5 d ב- 38.5 ° C עם 5% CO2.הערה: ייתכן שיהיה צורך פסקה אחת של וירוס רקומביננטי לפני מיון אם ישנם יותר מדי תאים בודדים GFP-ביטוי ושלטים GFP-חיוביים כמה הבאר המקורי. Passaging של וירוסים רקומביננטי הכנת לוחות 6-ובכן עם 1.3 x 10 תאים CEF6 לכל טוב יום לפני המעבר. 5 d postsorting, בדוק את הצלחות 96-ובכן תחת מיקרוסקופ זריחה. סמן הבארות המכיל שלט GFP-חיובית אחת.הערה: ראה איור 2A עבור שלט GFP-חיוביות נציג. Trypsinize כל GFP-חיובית עם 50 µL של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות, להוסיף 50 µL של תרבות מדיום, resuspend ולהעביר את התאים לתוך אחד טוב של צלחת 6-טוב עם CEFs. זה יהיה הדור הראשון של רקומביננטי HVT. הקציר הדור הראשון של וירוסים רקומביננטי בתלת-ממד אחר כך, להקפיא את בקבוקון אחד של כל 1 מ”ל להקפאת בינוני המכיל 10% עגל עוברית סרום (FCS), 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ו- 80% תרבות בינוני, לאחסן את וירוסים חנקן נוזלי.הערה: בתקופת הקציר משתנה בין 2-4 d בהתאם לקיבולת כמות והתפשטות של הנגיף. איסוף תאים5 עונה 1 פרק 10 של כל הדור הראשון של וירוסים, centrifuge אותם, ולמחוק את תגובת שיקוע. אחסן את התאים ב-20 ° C להפקת DNA. זיהוי של ההכנסה גנומית על ידי תגובת שרשרת פולימראזית להפקת DNA, הפשרה, resuspend בגדר תא מ שלב 3.2.4 עם 50 µL של מחיצות מאגר (10 מ מ טריס-HCl [pH 8], 1 מ”מ EDTA, 25 מ מ NaCl, ו- 200 µg/mL Proteinase K) ואת lyse הדגימות ב 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, , אז, ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות להשבית את ק’ Proteinase ביצוע של תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) עם 3′ צומת תחל (טבלה 1) באמצעות µL 1 של דנ א. עבור כל דגימה, הכנת המיקס התגובה 20 µL הבאים על הקרח: 2 x מיקס מאסטר PCR (10 µL), 10 מיקרומטר פריימר נגד הזרם (0.5 µL), 10 מיקרומטר במורד הזרם פריימר (0.5 µL), תבנית ה-DNA (1 µL) ומים ללא נוקלאז (8 µL). התוכנית הגברה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 95 ° C ל 30 s, 55 ° C ל 30 s, ו-72 מעלות 40 s מחזורים 35; 72 ° C עבור 7 דק 2 טען µL של המוצרים הגברה טוב אחד של 1% agarose ג’ל אלקטרופורזה בג’ל.הערה: ראה איור 2A עבור תוצאה נציג של 3′ צומת ה-PCR. 4. כריתה של ג’ין המערכת באמצעות Cre-הסלמון כתב פלורסנט כדי להסיר גן ה-GFP וירוס רקומביננטי, transfect 2 µg של Cre recombinase ביטוי פלסמיד המשקולת 6-ובכן, preseeded עם תאים CEF באמצעות תגובה כימית תקנים בעקבות ההוראה של היצרן. 12 שעות posttransfection, להפשיר בקבוקון אחד של וירוס רקומביננטי של חנקן נוזלי, resuspend בעדינות, זרע 50 µL לבאר כל התאים transfected והגדר באר אחת של הפקד שלילי עם אותה כמות של וירוס. תקופת דגירה של 3 d ב- 38.5 ° C עם 5% CO2. 5. פלאק טיהור תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון זרע שתי צלחות 96-ובכן עם 2 x 104 תאים CEF ליום טוב לפני מיון. בצע את ההליכים המתוארים שלב 3.1 postinfection 72 h (משלב 4) כדי להכין את התאים הנגועים למיון. למיין את התאים nonfluorescence יחיד לתוך צלחות 96-ובכן עם CEFs. Passaging של וירוסים רקומביננטי ואישור ה-PCR בוחר הפלאק nonfluorescence יחידה 5-10 5 d. postsorting, trypsinize אותם עם 50 µL של טריפסין-EDTA ב 38.5 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ולהוסיף 50 µL של תרבות בינוני עד resuspend את התאים.הערה: ראה איור 2B עבור שלט נציג GFP-שלילי. לעבור חצי של התאים לתוך כל טוב של צלחת 6-טוב preseeded עם CEFs כמו הדור השני. Centrifuge התאים הנותרים של כל המשובטים ב x 200 גרם במשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את התאים עם 50 µL של מחיצות מאגר להפקת DNA. לבצע PCR עם 5′ תחל בצומת (טבלה 1) באמצעות µL 1 של תבנית ה-DNA זהה PCR תגובת למצב כפי שמתואר בשלב 3.3.2.הערה: ראה איור 2B עבור תוצאה נציג של 5′ צומת ה-PCR. בהתבסס על תוצאות ה-PCR, לבחור שלושה עד חמישה שיבוטים חיובית של HVT רקומביננטי על קטעים נוספים ואימות. 6. אימות של HVT רקומביננטי Immunofluorescence עקיף assay להדביק CEFs עם הדור השני של רקומביננטי ש-HVT המתקבל שלב 5.2 בצלחת 24-ובכן נזרע עם 2.5 x 105 CEFs יום לפני זיהום. להסיר את postinfection 48 שעות של תרבות בינוני תא ולהוסיף 500 µL של 4% paraformaldehyde ב- PBS לתקן את התאים. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, לאחר מכן, הסרת מקבע את ולשטוף את שכבת תאים 3 x עם PBS.הערה: התאים ניתן לאחסן ב 4 ° C בשלב זה למשך מספר שבועות. להסיר את PBS ולהוסיף 500 µL של 0.1% טריטון X-100 כדי permeabilize את התאים עבור 15 דקות לשטוף התא שכבה 3 x עם PBS. בלוק כריכת ספציפי על-ידי הוספת חסימת מאגר (5%, שור סרום ב- PBS) לשעה. לדלל את נוגדנים חד שבטיים אנטי-VP2 נוגדן ראשוני HH7 או HVT-נגוע סרום עוף-1:200 במאגר חסימה, להוסיף µL 200 לאדם טוב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך ה 1 לשטוף התא שכבה 3 x עם PBS. לדלל נוגדנים משניים עז אנטי-העכבר IgG אלקסה 568 או עז עוף אנטי איג אלקסה 488-1:200 במאגר חסימה, להוסיף µL 200 לאדם טוב, דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח, לשטוף את התאים 3 x עם PBS. בדוק את הביטוי חלבון תחת המיקרוסקופ זריחה.הערה: ראה איור 4 עבור VP2 נציג צביעת תוצאה. רצף של הגן VP2 להגביר את רצף ה-DNA המתפרסות על-פני האזור intergenic UL45 ו- UL46 עם אמינות גבוהה DNA פולימראז ו תחל UL45-F1 ו UL46-R1 (טבלה 1) כדי לאתר את כל ההכנסה. מכינים את תערובת התגובה 50 µL הבאים: 5 µL של 10 x Pfx תערובת התגובה, µL 1.5 של 10 מיקרומטר במעלה הזרם מיקס פריימר במורד הזרם, µL 1 של 10 מ מ dNTP מיקס, µL 1 של 50 מ מ MgSO4, µL 1 של תבנית ה-DNA ואת 0.5 µL של Pfx DNA פולימראז , ולהוסיף מים נטולי נוקלאז 50 µL. התוכנית הגברה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 95 ° C 15 s, 55 ° C ל 30 s, ו- 68 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות 35 מחזורים. לטעון את כל המוצר PCR agarose 1% ג’ל אלקטרופורזה בג’ל. לטהר את המוצר PCR בעקבות ההוראה של ערכת טיהור DNA ג’ל. לשלוח µL 10 של המוצר PCR (30 ng/µL) חברת רצף כדי לאשר את טוק-אין של הגן VP2. 7. יציבות של וירוס רקומביננטי זרע 2.6 x 106 תאים CEF לתוך הבקבוק T25 כל יום לפני הרחבת וירוס. להפשיר לפחות שלושה שיבוטים חיוביים משלב 5.2; להוסיף בקבוקון אחד של תאים/וירוסים לתוך הבקבוק T25 בכל. דגירה ב 38.5 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 עד 50% אפקט ציטופתי נצפית. לקצור תאי 2 מ של תרבות בינוני; להדביק µL 50 אל בקבוק T25 החדש preseeded עם תאים CEF לדור הבא. לשמור passaging וירוס רקומביננטי לפחות 15 דורות. לנתח כל דור של וירוסים PCR לנוכחות של הרצף VP2 ועל ידי עקיפה immunofluorescence assay (IFA) לביטוי VP2 להעריך את היציבות של וירוסים רקומביננטי.