Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon
Summary
Elektroporasyon genler çıkarlarının hücrelere teslim etmek için etkili bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım içinde vivo yetişkin fare dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar üzerinde uygulayarak, biz axon yenilenme içinde vivoçalışmaya bir modeli açıklar.
Abstract
Elektroporasyon, DNA plazmidleri veya küçük RNA molekülleri hücre içine tanıtmak için bir temel viral gen transfection yaklaşımdır. Duyusal bir nöron dorsal kök gangliyon (DRGs) içinde iki şubeleri ile tek bir akson genişletir. Bir şube gider için periferik sinir (periferik Şube) ve diğer şube omurilik dorsal kök (Merkez Şube) yoluyla girer. Merkez Şube değil yeniden oluşturmaz, ancak sonrası sinir yaralanması, periferik şube sağlam yeniden oluşturur. Yüksek yeniden üretim kapasitesi nedeniyle, duyusal axon rejenerasyon yaygın bir modeli sistem olarak memeli axon rejenerasyon periferik sinir sistemi (PNS) ve merkezi sinir sistemi (MSS) eğitim için kullanılmıştır. Burada, biz olgun duyusal nöronlar içinde vivo elektroporasyon yoluyla Gen ifadesinin işlemek için daha önce kurulan yaklaşım iletişim kuralı tanımlamak. Transfection plazmidleri veya küçük RNA oligos (çift veya mikroRNA’lar) bağlı olarak, genler çıkarlarını veya mikroRNA’lar axon yenilenme içinde vivoYönetmelikte rolleri çalışmaya her iki kaybı ve kazanç-in-fonksiyonlu deneyler için yaklaşım sağlar. Buna ek olarak, gen ifade içinde vivo manipülasyon dağınık şekilde ve geçici bir nispeten kısa süreli sahası içinde kontrol edilebilir. Bu modeli sistem tarafından memeli axon rejenerasyon düzenlenmiş vivo içindeolan moleküler mekanizmaları araştırmak için eşsiz bir araç sağlar.
Introduction
Sinir sisteminde yaralanmaları sinirsel travma nedeni veya çeşitli nörodejeneratif hastalıklar genellikle motor, duyusal ve bilişsel işlevler hatalarına neden. Son zamanlarda, çok çaba fizyolojik functionsof yaralı nöronlar1,2,3geri yüklemek için yetişkin nöronlar rejeneratif güç yeniden kurulması için tahsis edilmiştir. Duyusal DRG nöronlarda sinir hücrelerinin ağrı, sıcaklık, dokunmatik veya vücut duruşu, beyin gibi farklı duyusal uyaranlara ifade bir küme vardır. Her bu nöronların sözde tek kutuplu ve çevre doğru uzanan bir dal ve doğru omurilik4başlık diğer dal ile bifurcates tek bir akson içerir. Onların aksonlar aktif yaralanma sonra yeniden oluşturmak için bilinen birkaç olgun memeli nöronlar DRGs yetişkin duyusal nöronlarda arasındadır. Dolayısıyla, duyusal aksonlar yaralanma yaygın olarak çok önemli bir model olarak aksonal yenilenme içinde vivomekanizmaları incelemek için istihdam edilmiştir.
Genellikle daha az zaman alıcı kurmak ve transjenik hayvanlar kullanmaktan daha esnek, in vivo gen transfection teknikleri, genlerin fonksiyonlarının eğitim ve yolları sinir sisteminde sinyal önemli roller oynayan edilmiştir. Ana teknikleri içine iki yaklaşımlar kategorize edilebilir: enstrüman ve virüs tabanlı5. Vivo Viral tabanlı gen teslim yetişkin nöronlar içinde kronolojik zamanmekansal manipülasyon kesin gen ifade6sağlayabilir. Ancak, emek yoğun işlemleri üretim ve arıtma istenilen gen içeren viral parçacıkların gibi viral tabanlı yöntemleri katılmaktadırlar. Buna ek olarak, birçok viral vektörler-ebil harekete geçirmek veri toplama, veri analizi ile engel ve muhtemelen deneysel sonuçlar yorumlanması saptırmak olan ana bilgisayarı bağışıklık sistemi. Gen vektörel çizimler veya küçük RNA oligos hücreleri7 dışında uzaydan akını ayrıcalıklı kılar geçici, hücre ve nükleer membran geçirgenliği artırmak için elektrikli bir darbe çoğalmasıyla, tipik araç tabanlı transfection yaklaşım kullanır . Vitro Elektroporasyon yaygın birçok hücre tipleri hedeflenen gen ifade değiştirmek için geçici ama son derece etkili bir strateji olarak kabul edilmektedir. Vivo Elektroporasyon sadece viral vektörler için karşılaştırıldığında düşük transfecting verimlilik ile geçici gen ekspresyonu için açar rağmen viral yaklaşımlar üzerinde çeşitli avantajları vardır. Örneğin, hemen hemen tüm doku ve hücreleri7,8,9için uygulanabilir. Buna ek olarak, belirli transkript karşı ilgi genleri veya küçük RNA oligos (Örneğin, çift, mikroRNA) kodlama ya plazmid olabilir doğrudan hedef dokusu içine enjekte ve sonra elektrikli darbeli, hangi yordamı daha az emek – yapmak ve zaman – tüketmek. Ayrıca, birden çok plazmit ve RNA oligos tek Elektroporasyon ile aynı anda transfecting mümkündür.
Biz bir vivo içinde adım yaklaşım gen ekspresyonu yetişkin fare duyusal sinir hücreleri içinde işlemek için kurulan ve başarıyla uygulanan ve böyle bir yaklaşım çok sayıda öncü çalışmalar1,2,3 doğrulanmış ,8,10. Burada, bu yaklaşım memeli axon rejenerasyon gelecekteki çalışmaları için kullanımını kolaylaştırmak için detaylı bir protokol mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çeşitli cerrahi adımları özellikle dikkat gerektirir. L4 ve L5 DRGs (somas konumunu), siyatik sinir hakim, doğru tespit ve gen yapıları ile enjekte gerekir. Aksi durumda, GFP etiketleme yok olur siyatik sinir aksonlar içinde. İliyak armalar L4 ve L5 DRGs kesin olarak belirlemek için yararlı anatomik simge görüntülenir. Farelerin çoğunda, L5 ve L6 omurları arasında eklem yüzünü iliyak armalar12‘ ye yakın eder. Cerrahi teshir edilmesi L5 DRG genellikle bir derin konum ve zengi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma finanse edildi (F-Q için verilmiştir. Z.) NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), Craig H. Neilsen Vakfı ve BrightFocus Vakfı tarafından.
Materials
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
Referências
- Saijilafu, , et al. PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1. Nature Communications. 4, 2690 (2013).
- Zhang, B. Y., et al. Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).
- Jiang, J. J., et al. MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression. Cell Death & Disease. 6, 1865 (2015).
- Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).
- Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).
- Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions. Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).
- Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Liu, C. M., et al. MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration. Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240 (1), 237-246 (2001).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nature Communications. 2, 543 (2011).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859 (2016).
- Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique. Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).
- Dommisse, G. F. The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).
- Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice. Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).
