التحقيق إكسون الثدييات التجديد: في فيفو انهانسر من العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار
Summary
انهانسر نهج فعال لتوصيل الجينات المصالح إلى الخلايا. بتطبيق هذا النهج في فيفو على الخلايا العصبية العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار (DRG)، يصف لنا نموذجا لدراسة إكسون التجدد في فيفو.
Abstract
انهانسر نهج تعداء جينات غير فيروسية أساسية لإدخال والبلازميدات الحمض النووي أو جزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة في الخلايا. العصبية حسية في العقدة الظهرية الجذرية (باﻷسعار) يمتد من إكسون واحدة بفرعين. فرع واحد يذهب إلى الطرفية العصبية (فرع الطرفية)، والفرع الآخر يدخل الحبل الشوكي من خلال الجذر الظهرية (فرع الوسطى). فرع الأجهزة الطرفية بعد الإصابة العصبية، تجدد قوة حين عدم تجديد الفرع المركزي. نظراً لارتفاع قدرة التجدد، تجديد إكسون الحسية وقد استخدمت على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة تجديد إكسون الثدييات في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) والجهاز العصبي المركزي (CNS). هنا، يمكننا وصف بروتوكول نهج المتبعة سابقا للتلاعب بالجينات في الخلايا العصبية الحسية ناضجة في فيفو عبر انهانسر. استناداً إلى تعداء مع البلازميدات أو أوليجوس صغيرة من الحمض النووي الريبي (سيرناس أو ميكرورناس)، النهج الذي يسمح لكل التجارب الخسارة والربح-من-وظيفة لدراسة أدوار الجينات للمصالح أو ميكرورناس في تنظيم إكسون التجدد في فيفو. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التحكم التلاعب بالجينات التعبير في فيفو مكانياً وزمنياً على حد سواء ضمن دورة زمنية قصيرة نسبيا. ويوفر هذا النظام النموذجي أداة فريدة للتحقيق في الآليات الجزيئية التي يتم التجديد إكسون الثدييات الخاضعة للتنظيم في فيفو.
Introduction
إصابات في الجهاز العصبي الناجم عن الصدمات العصبية أو أمراض الأعصاب المختلفة عادة ما تسفر عن العيوب في الوظائف الحركية والحسية والإدراكية. مؤخرا، قد كرس الكثير من الجهد لإعادة إنشاء قوتها التجدد في الخلايا العصبية الكبار لاستعادة الخلايا العصبية الفسيولوجية فونكتيونسوف أصيب1،2،3. الخلايا العصبية الحسية في الرسم هي مجموعة من الخلايا العصبية التي تنقل المنبهات الحسية المختلفة، مثل الألم، ودرجة الحرارة، واللمس، أو موقف الهيئة، إلى الدماغ. كل من هذه الخلايا العصبية الزائفة القطب الواحد ويحتوي على إكسون وحيدة التي إلى فرع واحد يمتد باتجاه المحيط وفرع أخرى تتجه نحو النخاع الشوكي4. من الخلايا العصبية الحسية الكبار في باﻷسعار بين الخلايا العصبية الثدييات ناضجة قليلة معروفة لتجديد على محاور عصبية بنشاط بعد الإصابة. ومن ثم الإصابات من محاور عصبية حسية على نطاق واسع استخدمت كنموذج بالغ الأهمية لدراسة آليات التجديد محواري في فيفو.
في فيفو تقنيات تعداء الجينات، وعادة ما تكون أقل استهلاكاً للوقت لإعداد وأكثر مرونة من استخدام الحيوانات المحورة وراثيا، لعب أدوار أساسية في دراسة وظائف الجينات وإشارات المسارات في الجهاز العصبي. ويمكن تصنيف التقنيات الرئيسية في نهجين اثنين: الفيروسات المستندة إلى صك و5. يمكن أن توفر على أساس الفيروسية في فيفو إيصال الجينات في الخلايا العصبية الكبار دقيقة التلاعب الزمانية المكانية ل التعبير الجيني6. ومع ذلك، تشارك عمليات كثيفة العمالة في الأساليب المستندة إلى الفيروسية، مثل إنتاج وتنقية الجزيئات الفيروسية التي تحتوي على الجين المطلوب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنشيط العديد من النواقل الفيروسية المناعي للبلد المضيف، والتي قد تتداخل مع الحصول على البيانات، تحليل البيانات، وربما تضليل تفسير النتائج التجريبية. يستخدم انهانسر، نهجاً تعداء المستندة إلى صك نموذجي، نبض كهربائية لزيادة نفاذية الخلية والأغشية النووية عابر، التي تفضل تدفق الجينات الناقلة أو الصغيرة رنا أوليجوس من الفضاء خارج الخلايا7 . في المختبر انهانسر المسلم به على نطاق واسع كاستراتيجية عابرة ولكنها ذات كفاءة عالية للتلاعب بالجينات المستهدفة في العديد من أنواع الخلايا. على الرغم من أن في فيفو انهانسر لا يؤدي إلا إلى التعبير الجيني عابر مع انخفاض كفاءة ترانسفيكتينج مقارنة بالنواقل الفيروسية، له مزايا مختلفة عبر نهج الفيروسية. على سبيل المثال، فإنه يمكن تطبيقها على تقريبا جميع الأنسجة والخلايا7،،من89. وباﻹضافة إلى ذلك، أما والبلازميدات ترميز الجينات في المصالح أو صغيرة أوليجوس الحمض النووي الريبي (مثلاً، سيرناس، ميكرورناس) ضد بعض النصوص يمكن حقنها في الأنسجة المستهدفة مباشرة وثم كهربائياً نابض، الذي جعل الإجراء العمل أقل-و الوقت المستهلكة. وعلاوة على ذلك، من الممكن ترانسفيكتينج والبلازميدات والجيش الملكي النيبالي أوليجوس في أن واحد مع انهانسر واحدة متعددة.
وقد أنشأنا في فيفو نهج انهانسر للتلاعب بالجينات في الخلايا العصبية الحسية الماوس الكبار وتطبيقها بنجاح والتحقق من صحة هذا النهج في عدة دراسات رائدة1،2،3 ،،من810. نقدم هنا، بروتوكول مفصلة لتسهيل استخدام هذا النهج للدراسات المستقبلية للتجدد إكسون الثدييات.
Protocol
Representative Results
Discussion
العديد من الخطوات الجراحية تتطلب اهتماما خاصا. L4 و L5 باﻷسعار (موقع حسام)، التي تهيمن على العصب الوركي، تحتاج إلى تحديد بشكل صحيح وحقن بنيات الجينات. خلاف ذلك، ستكون غائبة التجارة والنقل-وضع العلامات في العصب الوركي محاور عصبية. يمكن اعتبار القمم حرقفي المعالم التشريحية مفيدة لتحديد L4 و L5 ب…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومولت الدراسة (منح و-Q. Z.) من المعاهد الوطنية للصحة (R01NS064288، R01NS085176، R01GM111514، R01EY027347) ومؤسسة نيلسون H. كريغ ومؤسسة برايتفوكوس.
Materials
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
Referências
- Saijilafu, , et al. PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1. Nature Communications. 4, 2690 (2013).
- Zhang, B. Y., et al. Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).
- Jiang, J. J., et al. MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression. Cell Death & Disease. 6, 1865 (2015).
- Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).
- Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).
- Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions. Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).
- Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Liu, C. M., et al. MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration. Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240 (1), 237-246 (2001).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nature Communications. 2, 543 (2011).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859 (2016).
- Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique. Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).
- Dommisse, G. F. The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).
- Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice. Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).
