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Bioquímica

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58169
, , ,
1John Innes Centre

Summary

Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em folhas de Nicotiana benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno. Aqui é descrito um protocolo detalhado para produção em escala preparativa rápida (5 dias) de triterpenos e analogs utilizando esta poderosa plataforma baseada em vegetais.

Abstract

Os triterpenos são uma das maiores e mais estruturalmente diversas famílias de produtos naturais. Muitos derivados de triterpeno demonstraram possuir atividade biológica medicinalmente relevante. No entanto, até agora este potencial não traduziu em uma infinidade de drogas derivadas do triterpene na clínica. Este é sem dúvida (pelo menos parcialmente) uma consequência de acesso limitado de sintético prático para essa classe de composto, um problema que pode suprimir a exploração das relações estrutura-atividade e desenvolvimento de levar candidatos pelo tradicional medicinais fluxos de trabalho de química. Apesar de sua imensa diversidade, triterpenos são derivados de um precursor único e linear, 2,3-oxidosqualene. Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em s. benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno que não são produzidos naturalmente por esse host. Agro-infiltração é um meio eficiente e simples de alcançar a expressão transiente em s. benthamiana. O processo envolve a infiltração de folhas de plantas com uma suspensão de Agrobacterium tumefaciens , carregando o construct(s) expressão de interesse. Co infiltração de um adicional a. tumefaciens estirpe carregando uma expressão construção codificação uma enzima que aumenta significativamente o fornecimento de precursor aumenta rendimentos. Após um período de cinco dias, o material da folha infiltrados pode ser colhido e processado para extrair e isolar o produto (s) triterpeno resultante. Este é um processo que é linearmente e confiantemente escalável, simplesmente aumentando o número de plantas utilizadas no experimento. Aqui é descrito um protocolo para produção em escala preparativa rápida de triterpenos utilizando esta plataforma baseada em vegetais. O protocolo utiliza um aparelho facilmente replicável infiltração de vácuo, que permite a infiltração simultânea de até quatro plantas, permitindo a infiltração batch-wise de centenas de plantas em um curto período de tempo.

Introduction

Os triterpenos são uma das maiores e mais estruturalmente diversas famílias de produtos naturais. Apesar de sua imensa diversidade, todos os produtos naturais do triterpeno são acreditados para ser derivado do mesmo precursor linear 2,3-oxidosqualene, um produto da via do mevalonato em plantas. Ciclização de 2,3-oxidosqualene é iniciada e controlada por uma família de enzimas denominadas oxidosqualene cyclases (OSCs). Esta etapa de ciclização representa o primeiro nível de diversificação, com centenas de andaimes triterpeno diferentes tendo sido reportados de natureza1. Estes andaimes são ainda mais diversificados ajustando enzimas, incluindo, mas não limitado a, citocromo p450s (CYP450s)1,2. Tais vias biossintéticas podem levar a imensa complexidade, às vezes resultando em produtos finais que são quase irreconhecível de triterpeno o pai. Por exemplo, a estrutura complexa do potente inseticida e antialimentar limonoide azadiractina é acredita para derivar de um triterpeno fosfatase do tirucallane tipo3.

Muitos derivados triterpeno produtos naturais, mesmo aqueles com andaimes pai relativamente inalterado, demonstraram possuir atividade biológica medicinalmente relevantes4,5,6,7. No entanto, até agora este potencial não traduziu em uma infinidade de drogas derivadas do triterpene na clínica. Este é sem dúvida (pelo menos parcialmente) uma consequência de acesso limitado de sintético prático para essa classe de composto, um problema que pode suprimir a exploração das relações estrutura-atividade e desenvolvimento de levar candidatos pelo tradicional medicinais fluxos de trabalho de química.

Expressão transitória da triterpeno enzimas biossintéticas de outras espécies de plantas, em folhas de s. benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno (Figura 1). Este processo pode ser usado para caracterizar funcionalmente enzimas candidato e reconstruir as vias biossintéticas de metabólitos importantes ocorrem naturalmente. De igual modo, também pode ser explorada em combinatórias abordagens biossintéticas para produzir produtos de romance triterpeno, uma estratégia que pode resultar em bibliotecas de análogos estruturalmente relacionadas, permitindo a exploração sistemática das relações estrutura-atividade de chumbo biologicamente ativo compostos de8,9.

Agroinfiltration é um meio eficiente e simples de alcançar a expressão transiente em folhas de s. benthamiana . O processo envolve a infiltração das folhas com uma suspensão de a. tumefaciens carregando a expressão binário construct(s) de interesse. Isto é conseguido através da aplicação de pressão que força o líquido sobre os estomas, deslocando o ar no espaço intercelular e substituí-lo com a suspensão da . tumefaciens . As bactérias transferem os respectivos DNAs-T para o interior das células vegetais, resultando na expressão de proteínas localizadas e transitória no tecido folha infiltrados.

Enquanto qualquer vetor binário adequado para gerar plantas transgênicas pode ser empregada para expressão transiente, nós utilizamos o feijão-caupi Mosaic Virus CPMV-derivado Hypertranslational (HT) proteína expressão sistema10, 11. neste sistema, o gene de interesse é ladeado por regiões untranslated (UTR) do RNA o CPMV-2. Os 5′ UTR contém modificações, resultando em níveis muito elevados de translação de proteína com nenhuma dependência de replicação viral12. Esta técnica foi desenvolvida para a série de vetor binário de Easy-e-rápido (pEAQ) que inclui o site-specific recombinação clonagem compatível com o protocolo construções (pEAQ –HT– DEST)10,11. A maioria dos vetores pEAQ também contêm um tomate bushy stunt virus-derivado P19 silencioso supressor gene13 dentro a parte do T-DNA da fita expressão, que contorna a necessidade de coinfiltrate uma estirpe P19-carregando separada e proporciona muito expressão de proteínas de alto nível no acolhimento da planta célula10,11.

Uso do s. benthamiana , como um host de expressão tem vantagens particulares quando se trabalha com vias biossintéticas de planta. A arquitetura celular suporta intrinsecamente apropriado mRNA e processamento de proteína e compartimentalização adequada, além de possuir o necessárias co enzimas, redutases (para CYP450s) e precursores metabólicos. A fonte de carbono é fotossíntese; assim, as plantas simplesmente podem ser cultivadas em composto de boa qualidade, exigindo apenas água, CO2 (do ar) e luz solar como entradas. A plataforma também é extremamente conveniente para expressão co de diferentes combinações de proteínas, como isso pode ser conseguido facilely a infiltração de co de diferentes cepas de a. tumefaciens, eliminando a necessidade de construir grande expressão multigene fitas. Além disso, o processo pode ser linearmente e confiantemente escalado simplesmente aumentando o número de plantas utilizadas no experimento.

Trabalhos anteriores em nosso laboratório demonstrou a utilidade desta plataforma para experiências em escala preparativa. Isto incluiu a preparação de novos triterpenos para uso em ensaios de Bioatividade e escala até atingir quantidades de grama do produto isolado. Além disso, o acúmulo de produtos triterpeno heterogêneo pode ser aumentado vários dobram pela expressão co de uma forma N-terminal-truncada, diferenciação de gabarito de 3-hidroxi, 3-methyglutary-coenzima A redutase (tHMGR), um limitante upstream enzima na via do mevalonato8.

Chave para tais experiências em escala preparativa é a capacidade de convenientemente acima-escala o processo de infiltração. Em um experimento típico, dezenas a centenas de plantas podem ser necessária para alcançar a quantidade de destino do produto isolado. Infiltrando-se folhas individuais manualmente (usando uma seringa desnecessária) é operacionalmente exigentes e muitas vezes exageradamente demorado, tornando este método impraticável para escala-up de rotina. Infiltração de vácuo oferece vantagens sobre a infiltração de mão, pois não é dependente do nível de habilidade do operador e permite a infiltração de uma maior área de superfície da folha. Este procedimento é usado comercialmente para a produção em larga escala de proteínas farmacêutica14. Este protocolo utiliza um aparelho de infiltração facilmente replicável de vácuo, que pode ser construído a partir de peças disponíveis comercialmente. Isto permite a infiltração simultânea de até 4 plantas, proporcionando rápida e prática batch-wise infiltração de centenas de plantas em um curto período de tempo (Figura 2a -2b). O aparelho de vácuo infiltração consiste em um forno a vácuo que forma a câmara de infiltração (Figura 2f). O forno é ligado a uma bomba através de um reservatório de vácuo. Isso reduz muito o tempo necessário para atingir o vácuo desejado na câmara de infiltração. As plantas são fixadas em um suporte sob medido e invertidas em um banho de água de aço inoxidável de 10 L repleto da . tumefaciens suspensão (Figura 2a -2C). Imersão completa das partes aéreas das plantas é importante para a infiltração eficiente. O banho de água é então colocado dentro da câmara de infiltração (Figura 2d -2e) e o vácuo aplicado para desenhar o ar fora dos espaços intersticiais de folha. Uma vez que a pressão foi reduzida em 880 mbar (um processo que leva aproximadamente 1 min) câmara de infiltração é trazida rapidamente à pressão atmosférica 20-30 s, abrindo a válvula de entrada do forno, após infiltração é completa.

Cinco dias após a infiltração do material vegetal está pronto para colheita e subsequente de extração e isolamento do produto desejado. A partir deste ponto o processo é simplesmente um de extração de produtos naturais e purificação do material da folha, um fluxo de trabalho que é familiar para qualquer farmácia de produtos naturais. Muitos métodos diferentes para extração inicial e purificação subsequente existem15. A escolha mais adequada dos métodos e as condições exatas usadas é altamente dependente as propriedades químicas específicas do composto de interesse, além da disponibilidade de habilidades e/ou equipamento. Não é possível incluir no presente protocolo, um método totalmente generalizável, passo a passo para o processamento a jusante de material da folha da planta colhida ao produto isolado que pode ser seguido cegamente para qualquer produto triterpeno de interesse, nem seria apropriado para tentar fazê-lo. No entanto, este protocolo irá fornecer uma visão geral do fluxo de trabalho básico usado em nosso laboratório e alguns métodos para a fase inicial do processo, que, em nossa experiência provou generalizável para produtos de triterpeno aglicona mais oxigenados. Isso inclui duas técnicas relativamente incomuns, ou seja, extração de solvente pressurizado (PSE) e um método conveniente de fase heterogêneas para remoção de clorofila, utilizando uma resina de troca de íon fortemente básico.

PSE é uma técnica altamente eficiente para a extração de pequenas moléculas orgânicas de matrizes sólidas. As extrações são realizadas sob pressão (ca. 100-200 bar), a principal vantagem, sendo a capacidade de usar aliviadas temperaturas que excedam a ebulição ponto do solvente de extração. Isto pode significativamente reduzir o tempo e a quantidade de solvente necessária para alcançar uma extração exaustiva, quando comparado a outras técnicas de solventes quentes como refluxo simples ou Soxhlet extrações16. Instrumentos PSE de bancada comerciais estão disponíveis, que utilizam células de extração intercambiáveis e solvente automatizado, manipulação, aquecimento e monitoramento. Isto torna esta técnica extremamente conveniente. Também é indiscutivelmente menos nocivos, particularmente para os operadores com experiência limitada química prática.

Saponificação de extratos de folha crua sob refluxo seguido de particionamento de líquido/líquido é uma técnica comum para a remoção de massa de clorofilas antes da purificação subsequente ou análise. No entanto, isto pode muitas vezes ser operacionalmente exigentes em escalas maiores. Além disso, a deteção da interface, ou perda de produto devido à formação de emulsões pode ser problemática. A utilização de resinas de permuta iónica fortemente básicas para realizar a hidrólise heterogênea fase pode servir como uma alternativa conveniente. A porção pigmentada de clorofila a hidrolisado permanece aderida à resina e pode ser simplesmente removida por filtração. Este protocolo utiliza uma adaptação da escala preparativa de um procedimento analítico anteriormente relatados17 que emprega uma resina de troca iônica básicas disponíveis comercialmente.

Abaixo descrevemos um protocolo detalhado e rápido para a produção em escala preparativa de triterpenos utilizando esta plataforma baseada em vegetais. Este protocolo é usado rotineiramente em nosso laboratório para preparar dezenas a centenas de miligramas de produto triterpeno isolado para aplicações tal uma caracterização estrutural por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), e/ou um estudo mais aprofundado em funcional ensaios.

Protocol

Nota: Antes de seguir este protocolo, familiarizar-se com os dados de segurança do material para todas as substâncias utilizadas e tomar precauções de segurança adequadas. Estes incluem mas não estão limitados a: óculos de segurança quando se trabalha com vidro sob vácuo e manipulação de sílica gel em uma hotte. É também essencial que legislação local em matéria de trabalhar com material geneticamente modificado é verificada e observada, incluindo seguinte adequados procedimentos de contenção. 1. gerar cepas da . tumefaciens para infiltração Nota: Oferecemos aqui uma descrição simplificada das etapas necessárias para gerar adequado a. tumefaciens cepas para expressão transiente. Mais detalhes sobre essas etapas são descritas por Sainsbury et al 8. Amplificar pelo PCR ou sintetizar a proteína codificação do gene de interesse, ladeado por 5′ e 3′ sequências attB apropriadas para geração de um clone de entrada para uso com uma site-specific recombinação clonagem protocolo18,19. Usar primer Forward: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, primeira demão inversa: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN… = sequência específica de sequência). Usar as condições PCR (representante): amortecedor da reação mistura (25 µ l, total), (x 5, 5 µ l, consulte Tabela de materiais), dNTPs (10 mM, 0,5 µ l), para a frente da primeira demão (10 µM, 1,25 µ l), primer reverso (10 µM, 1,25 µ l), modelo de DNA (concentração variável, 50 – 250 ng, 0,5 µ l ), DNA polimerase (2000 U/mL, 0,25 µ l, consulte Tabela de materiais), a água livre de Nuclease (a 25 µ l). Execute o thermocycler como segue: desnaturação inicial (98 ° C, 30 s); iniciar o ciclo (98 ° C, 30 s; 45-72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30kb/s) terminar o ciclo; 35 ciclos; final extensão (72 ° C, 10 min). Siga uma padrão recombinação site-specific clonagem protocolo18,19 , para gerar um clone de entrada usando qualquer vetor de entrada não baseados em canamicina (usamos o pDONR207 que é comercialmente disponível).Nota: A integridade do clone entrada deve ser confirmada por sequenciamento, antes de usar para gerar o pEAQ -HT-DEST1 construção de expressão. O pEAQ -HT-DEST1 está disponível a pedido do laboratório de Lomonossoff no centro John Innes, em Norwich, Reino Unido. Isolar o pEAQ -HT-DEST1 vetor de expressão clone gerado no passo 1.1.3 e armazenar a-20 ° C antes de usar na etapa 1.3.Nota: Qualquer kit de purificação de plasmídeo baseados em colunas de rotação conveniente comercialmente disponível projetado para extrair o plasmídeo de clonagem de cepas de e. coli é adequado. Siga as instruções específicas da purificação do plasmídeo escolhido kit (veja a Tabela de materiais). Prepare-se quimicamente competentes a. tumefaciens para transformação. Inocular um seletivo LB (Luria-Bertani médio: 10 g/L bacto-triptona, 10 g/L de NaCl e extrato de levedura 5 g/L, pH de 10 g/L de ágar 7.0) placa de ágar (50 rifampicina μg/mL, estreptomicina 100 μg/mL) por estrias a. tumefaciens LBA4404 de uma cultura de estoque de glicerol. Incube durante uma noite a 28 ° C em uma incubadora de pé. Inocule 50 mL de meios LB líquidos selectivos (50 rifampicina μg/mL, 100 estreptomicina μg/mL) com uma amostra de células da . tumefaciens LBA4404 da etapa 1.2.1. Incube durante uma noite a 28 ° C numa incubadora agitando a 200 rpm. Então, pelota as . tumefaciens células por centrifugação a 4 ° C e 4500 x g por 5 min (descartar o sobrenadante) e esfriar a cultura da etapa 1.2.2 no gelo por 10 min. Resuspenda o pellet de passo 1.2.3 em 1 mL de gelado 20 mM CaCl2 aquoso e repita a etapa de centrifugação da etapa 1.2.3 (descartar o sobrenadante). Resuspenda o pellet de passo 1.2.4 em 1 mL de gelado 20 mM CaCl2 aquoso e alíquota a suspensão resultante em 50 lotes µ l. Flash congelar as alíquotas em líquido N2 e loja a-80 ° C antes de usar. Transformar o preparado a. tumefaciens LBA4404 com o pEAQ isolado -HT-DEST1 vetor gerado na etapa 1.2. Descongelar 50 µ l de suspensão da . tumefaciens gerado na etapa 1.2 no gelo e incubar com 100 \u2012 200 ng de pEAQ isolada -HT-DEST1 vetor, gerado na etapa 1.1, a 0 ° C por 5 min. Frio de choque a suspensão incubada da etapa 1.3.1 no líquido N2 por 30 s, então permitir para aquecer a temperatura ambiente. Adicionar 200 µ l de meio SOC (SOC: 20 g/L bacto-triptona, extrato de levedura 5 g/L, 0,58 g/L de NaCl, 0,19 g/L de KCl, 2,03 g/L de MgCl2, 7-hidrato de sulfato de magnésio de 2,46 g/L, glicose de 3,6 g/L) a suspensão frio chocada de step 1.3.2 e incubar durante 4 h 28 ° C numa incubadora agitando a 200 rpm. Inocule uma placa de ágar seletiva LB (50 rifampicina μg/mL, 50 canamicina μg/mL, 100 estreptomicina μg/mL) com a cultura SOC da etapa 1.3.3. Espalhar cuidadosamente e incubar durante 3 dias a 28 ° C em uma incubadora de pé. Inocule 5ml de meios selectivos de LB (50 rifampicina μg/mL, 50 canamicina μg/mL, 100 estreptomicina μg/mL) com uma única colônia da etapa 1.3.4. Incube durante uma noite a 28 ° C numa incubadora agitando a 200 rpm. Adicionar 200 μL de glicerol a 1 mL da cultura líquida da etapa 1.3.5, misture bem e armazenar a-80 ° C.Nota: Esta cultura pode ser revivida para futuros experimentos por estrias em placas de ágar LB com antibióticos apropriados (descritos abaixo). 2. prepare a suspensão de infiltração Inocular uma placa de ágar seletiva LB com estrias do desejado cepas da . tumefaciens do glicerol estoque culturas geradas na etapa 1. Incube durante uma noite a 28 ° C em uma incubadora de pé.Nota: Uma tensão carregando tHMGR dentro de um pEAQ -HT-DEST1 vetor pode também ser incluído. Individualmente, inocular 50 mL de meios selectivos de LB com uma amostra de cada cepa da . tumefaciens crescida no passo 2.1 e incubar durante uma noite a 28 ° C numa incubadora agitando a 200 rpm. Individualmente, transferir as culturas de 50 mL do passo 2.1.1 para 1000 mL de meios selectivos de LB (rifampicina 50 μg/mL, canamicina, 50 μg/mL Estreptomicina 100 μg/mL) e incubar durante uma noite a 28 ° C numa incubadora agitando a 200 rpm. Granule individualmente a a. tumefaciens por centrifugação (4000 x g), das culturas de líquido gerado na etapa 2.1.2 (descartar o sobrenadante). Resuspenda individualmente as pelotas de passo 2.1.3 em 50 mL de tampão MMA recentemente preparada (Buffer de MMA: ácido de-(N-morpholino)-ethanesulphonic 2 de 10 mM, pH 5.6 (KOH), 10 mM MgCl2, 150 μM 3′,5′-dimetoxi-4′-acetofenona) e incubar a temperatura ambiente a escuridão por 1h. Combine o volume apropriado de cada suspensão da . tumefaciens MMA (gerado na etapa 2.1.4) para produzir um final OD600 pelo menos 0,2 para cada microrganismo em um volume final total de 10 L. Adicione buffer MMA adicionais para as suspensões combinadas geradas na etapa 2.1.5 até um volume final de 1 L (uso imediatamente na etapa 3).Nota: É aconselhável preparar um adicional 2 L de suspensão de infiltração para manter o nível do líquido durante o processo de infiltração. Prepare 1 L de buffer de MMA 10 x força. 3. realizar a infiltração de vácuo Nota: Consulte a Figura 2 para obter uma descrição da construção de aparelhos de vácuo de infiltração. Use 5 semanas N. benthamiana plantas em vasos de 9 x 9 cm para as etapas do processo. Mudas devem ser semeadas no F1 composto (por exemplo, de Levington) e crescidas para 2 semanas antes de ser transferido para potes individuais contendo adubo F2. Plantas devem ser cultivadas em uma estufa a 25 ° C, com 16 h por dia de luz água (uso complementar de iluminação quando necessário), diariamente, densidade máxima de 100 plantas/m2. Transferi a 1 L de suspensão de infiltração gerado na etapa 2 e a 1 L de 10x buffer MMA força para o banho de infiltração, seguido por um adicional 8 L de água. Retire as asas destacáveis do titular da planta sob medida, insira 4 plantas (plantas de 5 semanas de idade ver Nota anterior) e recolocar as asas. Inverta o titular e coloque em cima do banho de infiltração a fim de submergir as folhas na suspensão de infiltração.Nota: Garantir que o nível de suspensão atinge a superfície superior do titular da planta. Elevar o nível com a adição de suspensão de infiltração extra se necessário. O banho de infiltração com plantas submersas de transferência para a câmara de infiltração e feche a porta. Certifique-se que a válvula de admissão de ar é fechada sobre o infiltrador. Ligue a bomba de vácuo e abra a válvula inline para o reservatório de vácuo seguido por válvula de admissão de vácuo na câmara de infiltração. Uma vez que a pressão na câmara de infiltração reduziu-se em 880 mbar, feche a válvula de admissão de vácuo e abrir a válvula de admissão de ar. Uma vez que a câmara de infiltração retornou à pressão atmosférica, abra a porta e remova o banho de infiltração. Levante o titular de planta até que as plantas já não estão submersos na suspensão de infiltração e, em seguida, agite suavemente o titular para permitir que o excesso suspensão falsificando as folhas de volta para o banho de infiltração. Retornar o titular para a posição vertical, remover as asas destacáveis e remover as plantas. Repita as etapas 3.1.1 à 3.1.5 até o número desejado de plantas têm sido infiltrado. Autoclave a suspensão de infiltração usado antes do descarte. Autoclave a infiltração banho antes da reutilização em experimentos subsequentes. Esterilizar o interior da câmara de infiltração por limpeza com etanol a 70% e deixar ao ar seco antes da reutilização em experimentos subsequentes. 4. crescer as plantas infiltradas Organize as plantas infiltradas da etapa 3, em uma densidade máxima de 100 plantas/m2 em uma estufa. Cresce durante 5 dias a 25 ° C e 16 h por dia de luz (uso complementar de iluminação quando necessário) e água diariamente. 5. colher as folhas infiltradas Após 5 dias de crescimento, colheita das folhas. Materiais de resíduos vegetais de autoclave, potes e solo antes do descarte. 6. seque as folhas colhidas Nota: O processo de liofilização exato descrito abaixo depende da natureza do aparato de liofilização disponível disponível. Lyophilize as folhas colhidas até secar. Coloque as folhas colhidas em um saco de polipropileno 2 mm de espessura. Congele as folhas colhidas, armazenando em um freezer-80 ° C por 30 min. Perfure a bolsa com muitos pequenos furos com um alfinete. Lugar deixa o ensacado congelado na câmara central do liofilizador. Certifique-se de todas as torneiras de acessório de balão estão fechadas e em seguida ligue o liofilizador. Garantir o condensador atinge pelo menos-50 ° C e a pressão reduz-se a pelo menos 0.15 mbar e então deixar durante a noite. Desligue o liofilizador e ventilação o vácuo através da abertura de uma torneira de fixação do balão. Remover as folhas secas da câmara central e vá para a etapa 7. 7. pressurizada extração solvente Nota: As etapas do processo referem-se ao uso de um instrumento PSE comercialmente disponível (ver Tabela de materiais). Consulte a literatura do fabricante para obter informações mais detalhadas sobre a operação. O instrumento realiza 4 extrações em paralelo. Moer as folhas secas em um pó de curso através de um método conveniente (por exemplo, para a maioria dos compostos triterpeno de interesse usar um processador de alimentos a doméstico, ou manualmente, esmagar as folhas enquanto contidos dentro de um saco).Nota: Moagem com um pilão e almofariz sob nitrogênio líquido não é geralmente necessário. Misture o pó de folha com areia de quartzo (0,3 \u2012 0.9 mm, 20% em volume) em um recipiente adequado; Este atua como dispersante e melhora a eficiência do processo de extração. Prepare-se 4 células de extração (120 mL) para o enchimento. Para isso, inverter as células de extração e insira o filtro de fibra de vidro, seguido da metal fritas e segurando o plug. Retornar as células de extração para o ereto posição e adicione uma camada profunda de 1 cm de areia de quartzo (\u2012 0,3 0,9 mm). Preencha as células de extração. Preencha as células de extração com o pó de folha preparado gerado na etapa 7.1 até a linha de enchimento. Se necessário, comprima suavemente o pó durante este processo para facilitar a adição de uma quantidade maior em cada célula de extração. Adicionar uma pequena camada de areia de quartzo (\u2012 0,3 0,9 mm) para o topo do pó embalado e inserir o filtro de celulose superior. Inserir as células extração embalado para o instrumento do PSE e executar o método desejado. Use as seguintes configurações e material; Solvente: 100% acetato de etila; temperatura: 100 ° C, pressão: 130 bar. Executar 3 ciclos da seguinte forma: ciclo 1: 0 min tempo de preensão, ciclo 2 e 3: 5 min tempo de preensão, terminam com um flush de solvente de 2 min e 12 min de nitrogênio gás flush.Nota: É aconselhável primeiro otimizar o método de extração em pequena escala. No entanto, o método a seguir é muitas vezes suficiente para mais oxidado triterpeno aglycones. O licor de cada célula de extração pode ser combinado no mesmo recipiente externo coleção especificando a linha de resíduos como o destino de extração, em vez de linhas individuais de coleção padrão. Esteja ciente de que a quantidade de solvente utilizado é dependente da embalagem de células a extração e a temperatura e a pressão. O método acima normalmente gera aproximadamente 800 mL de licor de extração para 4 extrações paralelas. Repita as etapas de 7.2 para 7.3.3 até todo o pó da folha foi processada. Concentre o licor de extração combinada de secura, através de evaporação rotativa sob vácuo. Verifique o resultado esperado (ou seja, chorume verde escuro).Nota: O procedimento exato pode variar dependendo do conjunto acima do evaporador rotativo disponível. Sempre use óculos de protecção quando realizando evaporação rotativa e verificar suas obras por danos antes de submeter-se às condições de vácuo. O reciclador de refrigerador e deixe o líquido de transferência de calor refrigerar a pelo menos 5 ° C. Prepara o banho de água e definir a temperatura de 35 ° C. O licor de extração de transferência para um balão de evaporação (não encher mais de metade do volume do frasco). Concentrar o licor batch-wise (no mesmo balão) se o volume total exceder isto. Anexe o balão de evaporação preenchido para o vapor-duto de evaporador rotativo (seguro com um clipe comum). Ajustar a posição do elevador de balão e o ângulo, a fim de mergulhar o fundo terceiro de balão de evaporação, o banho de água a um ângulo de aproximadamente 45 °. Inicie o balão girando a uma velocidade que começa a se espalhar o licor de extração até as paredes do balão. Certifique-se a torneira do respiradouro é fechada e começar a reduzir a pressão (usando o controlador da bomba de vácuo) até um gotejamento moderado é observado entre o condensador e receptor balão.Nota: Não permita que o licor de extração começar a ferver. Se isso ocorrer, reduza a força do vácuo para trazer a destilação sob controle. Monitorar e ajustar a velocidade vácuo, força e rotação, conforme o caso, até que todo o solvente é evaporado. 8. aniões resina tratamento para remoção de clorofilas Nota: As quantidades citadas nas etapas a seguir assumem uma escala de trabalho original de 100 plantas \u2012 150. Passo 8 não é adequado para produtos que contenham ácido carboxílico grupos, ou grupos funcionais que iria ser hidrolisados sob condições básicas, tais como ésteres. Dissolva o extrato bruto gerado na etapa 7, em um volume mínimo de etanol. Adicione 50 mL de grânulos de resina de aniões (ver Tabela de materiais) para a saída da etapa 7.1.1 e agitar em temperatura ambiente por 30 min.Nota: Não substitui a agitação para o uso de aparelhos de agitar. Sobrecarga mecânica ou magnética mexendo pode comprometer a integridade dos grânulos da resina. Agitação adequada também pode ser convenientemente alcançada pela rotação lenta do balão de reacção em evaporador rotativo com o vácuo definido à pressão atmosférica ou desconectado. Adicionar um adicional de 50 mL de grânulos de resina de aniões cada 30 min, até que a reação foi a conclusão; os grânulos de resina de aniões mudará de rosa com a cor verde, e a fase líquida mudará de verde para laranja ou uma cor marrom escura, dependendo da escala. Em caso de dúvida que a reação foi para conclusão, amostra 0,5 mL do líquido. Filtrar a amostra através de uma pequena coluna de terra diatomácea e observar a cor do filtrado; a reação é geralmente completa dentro de 1,5 h. Filtre a mistura de reação através de uma coluna curta de terra diatomácea. Realize isto através da filtragem de vácuo, ou através de uma coluna de cromatografia flash de vidro usando o fole de mão para aplicar pressão. Se retarda a taxa de filtração, perturbe o topo da terra diatomaceous almofada com uma haste de agita. Recolha o filtrado. Lave os grânulos de resinas coletadas com etanol, seguido de 1:1 etanol: hexano e, finalmente, hexano. Use um volume de abrilhantador suficiente para resuspend os grânulos no topo da coluna de terra diatomácea. Combinar o filtrado da etapa 8.4 e as lavagens da etapa 8.5 e concentrar à secura por evaporação rotativa sob vácuo. 9. inicial áspero fracionamento Nota: O seguinte método é geralmente apropriado para aglycones típico triterpeno oxidado e emprega um instrumento automatizado de cromatografia flash. Consulte a literatura do fabricante para mais detalhes sobre a operação. Absorver o produto bruto gerado na etapa 8 para o gel de silicone de grau flash (tamanho de poros: 60 Å, tamanho de partícula: 35 \u2012 75 μm) para aplicação em um cartucho de cromatografia flash através de metodologia de carga seca. Dissolva o produto bruto gerado na etapa 8, em um volume mínimo de solvente orgânico adequado. Assegure a completa dissolução.Nota: Diclorometano, com a adição de algumas gotas de metanol é geralmente uma escolha apropriada de solvente. Desparafusar a tampa de um cartucho de cromatografia flash pré-carregada de 100 g (ver Tabela de materiais) e remova o encaixe para revelar o espaço de cabeça de carga seca. Use o espaço de cabeça para medir o volume adequado de gel de sílica para carga seca. Transferir o volume medido do gel de silicone para carga seca para a solução do produto bruto e, em seguida, remover o solvente por evaporação rotativa sob vácuo.Nota: O gel de silicone deve retornar a um pó de fluxo livre. No final do processo suave atrito evaporação pode ser necessária para liberar o gel de silicone do lado do balão de evaporação. Equilibrar o cartucho de cromatografia flash 100 g em 100 mL/min, pelo menos 5 volumes de coluna de hexano 100%, mas idealmente até o conteúdo do cartucho totalmente e uniformemente molhado. Transferi o gel de silicone de preparado seco carregamento gerado na etapa 9.1.3 para o espaço de cabeça seco carregamento do cartucho cromatografia flash 100g equilibrado, derramando. Suspensão em hexano e uma pipeta de boca larga pode ser usado para auxiliar a transferência qualquer restantes carga seca de gel de sílica. Molhados, o gel de silicone de carga seca transferidos cama com 100% de hexano para retirar o ar do headspace de carga seca. Execute o seguinte método de cromatografia: solvente [A]: hexano, solvente [B]: acetato de etila, taxa de fluxo: 100 mL/min, gradiente: n [B] 0% a 100% [B] mais de 3000 mL, coleção: coletar todos, tamanho de fração: 250 mL. Analise as frações por fina camada de cromatografia (TLC)8 ou cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)8e concentração à secura do fraction(s) que contém o composto de interesse através de evaporação rotativa sob vácuo. Realize a purificação bem a jusante até o nível de pureza desejado seja alcançado.Nota: Purificação de bem a jusante é inteiramente composto específico e não é possível fornecer medidas padronizadas (consulte a seção de discussão).

Representative Results

Típicos rendimentos isolados são dependentes da combinação enzima/enzima sob investigação, a estabilidade química do composto alvo, e como foi o desafio do processo de purificação. Informamos anteriormente isolados rendimentos de β-amirina derivados de nossas experiências de biossíntese combinatorial variando de 0,12 a 3,87 mg por grama de seco em pó de folha de s. benthamiana . Estes compostos variaram amplamente no nível de oxidação e incluíram antinaturais combinações de enzimas (Figura 3)8. Este protocolo é usado rotineiramente em nosso laboratório para produzir dezenas ou centenas de miligramas de produto purificado para caracterização estrutural por espectroscopia RMN e ensaios funcionais a jusante. Também demonstrámos o utilitário preparativa desta plataforma, produzindo 0,8 g do triterpeno andaime β-amirina em um grau de pureza superior a 98%. Este experimento 459 plantas usadas e representa um rendimento isolado de 3,3 mg por grama de seco N. benthamiana folha pó8. Figura 1: Resumo esquemático. Representação esquemática do processo de exploração expressão transiente de enzimas biossintéticas na folha de s. benthamiana para desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para produção de novos produtos de alto valor triterpeno preparativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: vácuo infiltrador construção e processo. um) Bespoke planta titular uma ala separada. asas da titular da planta b) Bespoke anexadas. c) inversão e submersão das plantas. d) inserção do banho de infiltração. banho e) infiltração no lugar dentro da câmara de infiltração. f) Complete infiltrador de vácuo: bomba de vácuo (1) (2) Conexão da bomba de vácuo, a válvula de isolamento do reservatório de vácuo (3) vácuo reservatório (4) a Conexão entre o reservatório de vácuo e a válvula de admissão de ar (5) medidor de pressão (6) (7) infiltração câmara Reservatório de vácuo de câmara (8) infiltração. g) representante folhas de uma planta, infiltrou-se com uma expressão de construção para a proteína verde fluorescente (GFP), após crescimento de infiltração após cinco dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: anteriormente relatados resultados representativos para a produção preparativa de derivados de β-amirina usando este protocolo8. Esta tabela é ordenada por rendimentos isolados. Colunas são formatadas condicionalmente com indicação de cor de valor relativo. Vermelho = alta, verde = baixa (embora intermediário amarelo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Coloque-através de-alto vácuo infiltração permite que este protocolo a ser usado rotineiramente em nosso laboratório para a produção preparativa triterpeno compostos de interesse para várias aplicações a jusante. O aparelho de vácuo infiltração descrito aqui é facilmente replicado. Adição do reservatório de vácuo é aconselhável diminuir o tempo necessário para puxar o vácuo necessário, no entanto, é possível simplesmente adaptar um forno de vácuo sem modificações como a câmara de infiltração. Proteger a bomba de vácuo através da adição de um condensador apropriado é teoricamente sensato, mas em nosso laboratório, encontrámos este é desnecessário.

Cobertura de infiltração é comprometida se as folhas não são totalmente imersa na suspensão de infiltração. Este problema é minimizado, garantindo que o nível da suspensão atinge a superfície superior do titular da planta, e que o titular de planta tem um ajuste apertado para o banho de infiltração. Observação da Figura 2 que a superfície superior do titular da planta é embutida para o banho de infiltração quando estava no lugar. Isto é conseguido através de painéis nas bordas médios do titular que formam o ponto de ancoragem com a parte superior do banho de infiltração. A suspensão de infiltração exigirá adições periódicas para manter o nível de suspensão. Isto é melhor conseguido pela adição de suspensão de infiltração em excesso para evitar a redução gradual do OD600 ao longo de uma grande infiltração batch-wise. No entanto, em nossas mãos, substituição por água não parece ter um efeito perceptível sobre rendimentos esperados em escala preparativa, embora isso não tenha sido quantitativamente investigada. Como muitas plantas podem estar infiltradas de um lote de suspensão de infiltração é ainda uma questão em aberto. Nós rotineiramente se infiltrar entre 100 e 200 plantas com um único lote de suspensão de infiltração. Além disso, é normal para um solo lixiviar para a suspensão de infiltração ao longo do processo de infiltração. Isto não foi encontrado para ter um efeito perceptível sobre a eficácia da infiltração.

Durante a colheita, é aconselhável (mas não críticos) para colher somente as folhas que foram infiltradas (algumas folhas terá crescido pós-infiltração). Colheita seletiva impede a diluição com tecido improdutiva, que caso contrário iria aumentar a proporção de impurezas endógenas relativo para o composto de interesse. Isto tem um impacto nominal sobre a facilidade de purificação a jusante e aumenta a escala destes processos. Ao usar o tHMGR para aumentar o fornecimento de precursor, um fenótipo necrosado é frequentemente observado a desenvolver ao longo do período de crescimento pós-infiltração. Isto é normal e realmente auxilia a colheita seletiva e o processo de secagem a jusante. O pó de folhas secas geralmente pode ser armazenado em um recipiente fechado em local fresco, seco e escuro, mas idealmente em um dessecador, sob vácuo. Isso depende da estabilidade do composto do interessado. Tenha cuidado se optar por armazenar em um freezer-80 ° C. Garantir que as secas folhas são em um recipiente impermeável e à saída do armazém, permitir que este recipiente para aquecer a temperatura ambiente antes da abertura. Para fazê-lo resultará em rewetting das folhas, dificultando o processamento de jusante.

As etapas pós-colheita no presente protocolo são fornecidas para fins ilustrativos, e para ajudar os pesquisadores que podem ter limitado a química prática experimentam. Eles podem ser substituídos por muitas outras técnicas de extração/purificação de produtos naturais. Conforme detalhado na introdução, PSE tem muitas vantagens, no entanto, o capital custo do aparelho comercialmente disponível do PSE pode ser proibitivo e não é essencial. Tratamento de resina de troca iônica básica é um método muito conveniente para substituir o tradicional saponificação seguida de particionamento de líquido/líquido. No entanto, não é apropriado para produtos contendo grupos carboxila ou grupos funcionais que iria ser hidrolisados sob condições básicas, tais como ésteres. Estes produtos se esperaria ser retidos na resina aniões. No entanto, há potencial para explorar isto para uma captação e liberação de procedimento (não documentado). Onde saponificação tradicional seria adequada, tratamento de resina de troca iônica básica serve como uma alternativa conveniente. O método de cromatografia descrito na etapa 9, foi encontrado para ser generalizados para os compostos descritos na Figura 3. No entanto, compostos de polaridade aumentada podem exigir um longo período de eluição de acetato de etila de 100%. Com referência a passo 9.2, purificação bem a jusante é inteiramente composto específico e também é dependente da escala. Repetidas rodadas de cromatografia flash de menor escala com gradientes otimizados, é geralmente suficiente para atingir um grau de pureza adequado para análise de NMR. Em escalas maiores, a cristalização é muitas vezes uma alternativa conveniente. Em casos difíceis, preparativa ou semipreparativa alta cromatografia líquida (HPLC) pode ser empregada dependendo da quantidade desejada de composto isolado. Exemplos de processos de purificação a jusante para uma gama de compostos representativos podem ser encontrados em outro lugar8.

O protocolo atual, tal como apresentado aqui, é usado rotineiramente em nosso laboratório e tem provado a utilidade. No entanto, há ainda ampla margem para mais otimização da plataforma de expressão. Trabalho está em andamento em nosso laboratório para investigar como mais engenharia de via e controle diferencial de níveis de expressão da proteína poderia melhorar a produção de triterpeno ainda mais, enquanto mediando toxicidade às células hospedeiras. Há também potencial para investigar a manipulação de sistemas de transporte intracelular20,21e a direção de enzimas para diferentes compartimentos celulares22,23, avenidas que poderiam melhorar a eficiência de vários eventos de oxidação. Benefícios potenciais para modificar a morfologia subjacente de organelas chaves também podem ser explorados. Por exemplo, a superexpressão do domínio de membrana de Arabidopsis thaliana HMGR tem sido observado para induzir a hipertrofia do retículo endoplasmático em plantas24; um site fundamental para atividade CYP450. Este protocolo é ideal para a produção de miligrama de grama-escala as quantidades de produtos triterpeno e pode ser empregado em um ambiente de pesquisa para acessar compostos para estudo a jusante (por exemplo, a exploração sistemática de estrutura-atividade relacionamentos e investigações preliminares em que as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de chumbo compostos de interesse clínico). No entanto, a plataforma é linearmente e confiantemente escalável simplesmente aumentando o número de plantas usadas e o sentido prático da expressão transiente através de agroinfiltration foi demonstrada em escala industrial para a produção de proteínas farmacêuticas 14, portanto há potencial para esta plataforma a ser estendido para a produção comercial de triterpenos de alto valor. Como alternativa, também é possível vislumbrar a produção de transformants estável, carregando o desejo finalizado multigene biossintético, permitindo o cultivo em massa e continuou ‘agricultura’ de transgénicos N. benthamiana cepas produção de diferentes compostos de valor comercial.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por um Norwich Research Park Studentship (JR), a engenharia conjunta e Conselho de pesquisa de ciências físicas/biotecnológico e financiados pelo Biological Sciences Research Council BBSRC OpenPlant sintético biologia centro de investigação concedem (BB / L014130/1) (FIBROCIMENTOS, ENTRE OUTROS); uma troca de conhecimento do John Innes Centre e comercialização concedem (BB/KEC1740/1) (APA); e a concessão de programa estratégico do Instituto BBSRC ‘Moléculas de natureza’ (BB/P012523/1) e o John Innes Foundation (A.O.). Gostaríamos de agradecer a George Lomonossoff para fornecer os pEAQ vetores e Andrew Davis para a fotografia.

Materials

GC-MS instrument any n/a
Thermocycler suitable for performing PCR reactions any n/a
Gel electrophoresis apparatus any n/a
Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) any n/a
Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) any n/a
Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) any n/a
Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) any n/a
Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) any n/a
Standing incubator any n/a
Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) any n/a
Centrifuge bottles (1 L) any n/a
Vacuum infiltration apparatus bespoke n/a
9 x 9 cm plant pots any n/a
Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) any n/a
Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) Buchi SpeedExtractor E-914
Rotary evaporator apparatus any n/a
Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) any n/a
Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) any n/a
Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) any n/a
Spatulas (assorted sizes) any n/a
Analytical balance (5 figures) any n/a
Balance (2 figures) any n/a
Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) any n/a
A -80 freezer any n/a
Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument Biotage ISO-1EW
Safety glasses any n/a
Lab coat any n/a
Autoclave any n/a
Consumables
Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) any n/a
Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) any n/a
Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) any n/a
Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) any n/a
Petri dishes (Size: 100 mL) any n/a
Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges Biotage FSK0-1107-0100
HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps any n/a
Disposable purple nitrile gloves any n/a
Top filter for E-914, cellulose Buchi 51249
Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber Buchi 11055932
Reagents
Quartz sand, 0.3 – 0.9 mm Buchi 37689
Celite 545 (diatomaceous earth) Simga-Alrich 22140-1KG-F
Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) Merck 1.09385.5000
2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid Melford B2002
MgCl2 Simga-Alrich 208337-100G
KOH Simga-Alrich 60377-1KG
3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) Simga-Alrich D134406-1G
Rifampicin Alfa Aesar J60836
Kanamycin sulfate Gibco 11815-032
Streptomycin Simga-Alrich S6501-100G
Gentamycin MP biomedicals 190057
Agarose LE gel Melford MB1203
LB broth Millar Simga-Alrich L3522-250G
Agar Simga-Alrich A5306-250G
NaCl Simga-Alrich S5886-500G
KCl Simga-Alrich P9541-500G
MgSO4.7H2O Sigma-Alrich M2773-500G
Glucose Sigma-Alrich G7021-100G
Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) Sigma-Alrich 06476-1KG
Hexane Fisher H/0406/PB17
Ethyl acetate Fisher E/0900/PB17
Dichloromethane Fisher D/1852/PB17
Methanol Fisher M/4056/PB17
Ethidium bromide Sigma-Alrich E7637-1G
Ethanol VWR 20821-330
Milli-Q water any n/a
Levington F1 Compost any n/a
Levington F2 Compost any n/a
QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). Qiagen 27104
NEB 5-alpha Competent E. coli Supplier New England Biolabs Ltd C2987I
pEAQ-HT-DEST1 vector Lomonossoff laboratory John Innes Center n/a
pDONR207 Thermo-Fisher pDONR207
A. tumefaciens LBA4404 Thermo-Fisher 18313015
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) Thermo-Fisher 11791020
GATEWAY BP CLONASE ™ II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) Thermo-Fisher 11789020
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX Promega UK Ltd M7822
PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE New England Biolabs Ltd M0530S
dNTP SET 100mm Thermo-Fisher 10297018
RNEASY PLANT MINI KIT Qiagen Ltd 74904
RQ1 RNASE-FREE DNASE Promega UK Ltd M6101
Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System Fisher 10308632
Trytone Sigma-Alrich T7293-250G
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier n/a
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Referências

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Stephenson, M. J., Reed, J., Brouwer, B., Osbourn, A. Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale. J. Vis. Exp. (138), e58169, doi:10.3791/58169 (2018).
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