Hier beschrijven we een protocol voor te bereiden en handhaven van hypofyse en primaire celculturen van medaka (Oryzias latipes). De geoptimaliseerde voorwaarden in dit protocol rekening belangrijke parameters zoals temperatuur, osmolaliteit en pH door het nabootsen van de fysiologische omstandigheden van de vis, waardoor fysiologisch meer zinvolle resultaten.
Primaire celculturen is een krachtig hulpmiddel gebruikt door wetenschappers bij het bestuderen van cellulaire eigenschappen en mechanismen van geïsoleerde cellen in een gecontroleerde omgeving. Ondanks de enorme verschillen in de Fysiologie tussen zoogdieren en vissen, zijn de protocollen van de cultuur van de primaire cel van vis vaak gebaseerd op zoogdieren kweekomstandigheden, vaak met slechts kleine wijzigingen. De ecologische verschillen van invloed zijn op niet alleen de lichaamstemperatuur, maar ook het bloedserum parameters zoals osmolaliteit, pH en buffercapaciteit van de pH. Als cel cultuurmedia en soortgelijke werkoplossingen zijn bedoeld om na te bootsen de kenmerken van de extracellulaire vloeistof en/of bloedserum waarnaar een cel aangepast wordt, is het van cruciaal belang dat deze parameters zijn aangepast specifiek aan het betrokken dier.
Het huidige protocol beschrijft geoptimaliseerde primaire kweekomstandigheden voor medaka (Oryzias latipes). Het protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe te isoleren en handhaven van gezonde losgekoppeld hypofyse cellen voor meer dan een week en bestaat uit de volgende stappen: 1. de aanpassing van de osmolaliteit de waarden gevonden in medaka bloedplasma, 2. de aanpassing van de incubatietemperatuur tot normale medaka temperatuur (hier in de aquarium faciliteit), en 3. de aanpassing van de pH en bicarbonaat buffer waarden vergelijkbaar met andere vissoorten leven bij soortgelijke temperaturen. De resultaten gepresenteerd met behulp van het protocol beschreven fysiologisch zinvolle resultaten voor medaka bevorderen en als een naslagwerk kunnen worden gebruikt door wetenschappers maken van primaire celculturen van andere diersoorten bij niet-zoogdieren.
Cultuur van de cel is één van de belangrijkste instrumenten in moleculair biologisch onderzoek, biedt een uitstekende modelsysteem voor het beantwoorden van verschillende biologische vragen variërend van normale cellulaire fysiologie tot drug screening en carcinogenese1gebruikt. Primaire cellen, rechtstreeks van het dierlijk weefsel met behulp van enzymatische en/of mechanische methoden, geïsoleerd worden vaak beschouwd als een meer biologisch relevant dan cellijnen als de biologische reactie dichter bij de in vivo situatie worden kan. Protocollen voor het voorbereiden van primaire celculturen moeten worden geoptimaliseerd voor elk soort en cel type van belang om te bootsen de kenmerken waarnaar een cel aangepast is en fysiologisch zinvolle resultaten te verkrijgen.
Talrijke protocollen beschrijven kweekomstandigheden voor zoogdiercellen systemen, terwijl soortgelijke protocollen beschrijven van primaire kweekomstandigheden voor vis cellen eerder schaars in vergelijking zijn. Cellen zijn gevoelig voor snelle veranderingen in de temperatuur, pH en de osmolaliteit, en zijn vooral kwetsbaar tijdens de procedure dissociatie. Commerciële zoutoplossingen en Kweekmedia gebruikt voor zoogdieren celculturen zijn niet optimaal voor teleost vis, met name wat betreft de pH buffer systemen en de osmolaliteit. Het is daarom belangrijk om te meten en aanpassen van de oplossingen voor fysiologisch relevante niveaus van deze parameters in de soorten van belang.
Primaire hypofyse culturen zijn gemaakt van verschillende vissoorten van de teleost, met inbegrip van de karper (Cyprinus carpio)2,3, gras carp (Ctenopharyngodon idella)4, goudvis (Carassius auratus )5, regenboogforel (Oncorhynchus mykiss)6, Europese aal (Anguilla anguilla)7, tilapia (Labeo fimbriatus)8, zebravissen (Danio rerio)9, en Kabeljauw (Gadus morhua)10. Afgezien van het aanpassen van de incubatietemperatuur tot de soorten van belang, hebben verscheidene van deze protocollen de cellen bij zoogdieren-achtige omstandigheden die voor de soorten van belang, met een pH van 7,2 tot 7,5 in een bevochtigde sfeer suboptimaal zijn kunnen geïncubeerd. met 3-5% CO2. Bovendien is het onduidelijk of de osmolaliteit van oplossingen gebruikt voor het voorbereiden van verscheidene van deze primaire celculturen werden aangepast en stabiel tussen verschillende oplossingen.
Het huidige protocol is gebaseerd op eerdere werk met primaire culturen van kabeljauw10 en omvat aanpassingen van incubatietemperatuur, osmolaliteit, pH en pH buffer systemen, met inbegrip van de gedeeltelijke druk van kooldioxide (pCO2), om te de Fysiologie van medaka (O. latipes). Medaka is een zoetwatervis van kleine (3-4 cm), inheems in Oost-Azië. Deze dagen, wordt het gebruikt als een soort model in veel onderzoekslaboratoria over de hele wereld, want het is relatief eenvoudig te kweken en zeer resistent tegen veel voorkomende vis ziekten11. Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van medaka als een model, met inbegrip van een temperatuur tolerantie van 4 – 40 ° C11, een korte generatietijd, transparante embryo’s, een seks-bepalen gene12, en een gesequenceerd genoom13, evenals veel andere beschikbare genetische hulpbronnen.
De primaire kweekomstandigheden in dit protocol worden geoptimaliseerd zodat deze overeenkomen met de temperatuur van 26 ° C die medakas worden bewaard in de vis-faciliteit. Verder is de osmolaliteit wordt teruggebracht van 320 mOsm/kg van kabeljauw leeft in zout water tot 290 mOsm/kg voor medaka leven in zoet water en is in overeenstemming met de normale osmolaliteit van medaka plasma14. In vergelijking is de typische osmolaliteit van zoogdieren plasma in het bereik van 275-295 mOsm15. Vissen leven in een verscheidenheid van temperaturen en hebben kieuwen die in direct contact met water, waardoor de pH en buffer capaciteit van het bloed en het extracellulaire vloeistof in vis afwijken bij zoogdieren. Zoogdieren voedingsbodems bestaan meestal uit buffer-systemen die leiden tot een pH van ongeveer 7.4 wanneer de media zijn geëquilibreerd aan een standaard sfeer van 5% CO2 in bevochtigde lucht bij 37 ° C. De pH is afhankelijk van temperatuur en de waarde voor de verhoging van de neutrale pH (in water) met een dalende temperatuur-16. Typisch teleost vis plasma pH varieert van 7,7 7,917. De optimalisering van dit protocol opgenomen een reductie van pH 7.85 voor kabeljauw bij 12 ° C tot pH 7,75 voor medaka gehouden bij 26 ° C door het verhogen van de CO-2 van 0,5% tot 1% beperkt.
Daarnaast is de buffercapaciteit van bicarbonaat heel anders in vissen en zoogdieren. CO2 gemakkelijk worden verzonden via de kieuwen in vis en de pCO2 in water is slechts een klein deel van de pCO2 in de Long-18. De temperatuur of de pCO2 wijzigt, de pH en de buffer van het medium. Noch de pCO2 aanbevolen voor het broeden van zoogdiercellen als de pH dus optimaal voor vis cellen, en daarom moet de voedingsbodems worden geoptimaliseerd met buffer systemen met fysiologisch relevante waarden voor vis en de bepaalde soorten van belang. Dit protocol beschrijft hoe te bereiden van primaire celculturen van medaka pituitaries en omvatten aanpassingen van de incubatie temperatuur, osmolaliteit, pH en pH buffersysteem, naast andere belangrijke parameters te overwegen bij de voorbereiding van de oplaadbare batterij bij niet-zoogdieren soorten culturen.
In vitro cel cultuur systemen bieden krachtige hulpmiddelen voor onderzoekers een overvloed aan verschillende biologische vragen beantwoorden als gebruikt in de juiste manier1. Het is belangrijk te onthouden dat gedissocieerde cellen die verloren hun verbindingen met de naburige cellen hebben verschillende functionele eigenschappen verkregen wellicht dan ze oorspronkelijk had in vivo. Om te voorkomen dat gevaar voor verkeerde uitleg van de resultaten uit in vitro experim…
The authors have nothing to disclose.
Dit project werd gefinancierd door de Noorse Universiteit van levenswetenschappen en de Raad onderzoek van Noorwegen, subsidie aantal 243811 en 244461 (aquacultuur programma). We zijn dankbaar Lourdes Carreon Tan aan de Noorse Universiteit van levenswetenschappen voor het behoud van de vis-faciliteit.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium. |
D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium. |
GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 µg/ml Streptomycin). |
Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution. |
Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straigt tip |
Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
Fine needles / insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |