Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar
Summary
Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.
Abstract
Efferocytosis Yönetmeliği okuyan ve doğru bir şekilde apoptotik hücreler alımını ölçmek için efferocytosis kontrol sinyal ve hücresel işlemleri soruşturma için yöntemler gerektirir. Bu miktar böylece doğru bir şekilde apoptotik hedef karşı artık unengulfed cep efferocytosed kısmı arasında betimlemek Yöntemler gerektiren çoğu kez efferocytosed parça parça, apoptotik hücreler gibi yapmak zor olabilir parçaları. Burada özetlenen yaklaşım doğru makrofajlar gibi efferocytes efferocytosis ve efferocytic kapasitesini dinamikleri ölçmek için çift etiketleme yaklaşımlar kullanır. Apoptotik hücre sitozol apoptotik hücre yüzey biotinylation farklılaşma için sağlar internalized ve sigara içselleştirilmiş arasında iken tüm apoptotik hücre kaynaklı malzemeler, izleme özelliğini etkinleştirme bir hücre izleme boya ile etiketlenir apoptotik hücre kesirler. Canlı ya da sabit hücre floresan fotoğraf çekmek ve streptavidin boyama tarafından Ayrıştırılan gibi ilişkili içselleştirilmiş hedefleri karşı miktarı miktarının efferocytes efferocytic kapasitesini belirler. Bu yaklaşım yöntemleri akış sitometresi, yani efferocytosed apoptotik hücre kesirler, efferocytic dynamics tarafından canlı-cep mikroskobu, ölçmek için yetenek karşı efferocytosed doğru tarif gibi birçok avantaj sunar ve hücresel fluorescently etiketli transgenes ifade hücrelerde sinyalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek için kapasite. Birlikte, bu protokol için özetlenen yöntemleri doğru efferocytic etkinliğini ölçmek ve hücresel sinyal yolları efferocytosis sırasında etkin sorguya çekmek için kullanılan esnek bir deneysel yaklaşım için temel olarak hizmet vermektedir.
Introduction
Apoptozis veya programlanmış hücre ölümü, en çok hücreli canlılar arasında oluşur ve onların gelişme ve homeostasis1için son derece önemli bir son derece düzenlenir fizyolojik süreçtir. Ek olarak normal hücre ciro ve embriyonik geliştirme dahil olmak, apoptozis dokular enfekte veya hasarlı hücreleri ortadan kaldırılması sağlar ve yanıt enfeksiyon, inflamasyon, kanser ve aynı zamanda tıbbi müdahaleler tarafından tetiklenebilir radyoterapi veya steroid1gibi. Apoptotik hücreleri göstermek “ye-bana” fagositler, profesyonel ve profesyonel olmayan bir dizi reseptörler tarafından tanınan sinyalleri onların hücre yüzeyinde topluca “efferocytes” anılacaktır. Bu reseptörler nişan alımı ve apoptotik hücre bozulması efferocyte efferocytosis2,3bilinen işlem aracılığıyla tarafından neden olmaktadır. Fosfatidilserin en iyisi karakterize yemek-sürüş efferocytosis işaret. Normalde plazma zarı iç broşür böylece açığa Fosfatidilserin hücre yüzey4‘ te bu membran asimetrisi bozan bir lipid scramblase aktive apoptozis ile sınırlanır. Fosfatidilserin olgun makrofajlar gibi bazı sigara apoptotik hücre hücre dışı yüzeyinde bulunan ve trombosit aktive. Ancak, bu hücreler efferocytosed “beni yeme” gibi sinyallerini CD47, onların hücre yüzey5,6,7varlığı nedeniyle değildir. Maruz Fosfatidilserin efferocytic reseptörleri efferocytes tarafından ifade edilen bir dizi tarafından kabul edilmektedir. Bu reseptörler Fosfatidilserin için bağlama, doğrudan veya opsonins, yardım yoluyla etkinleştirir apoptotik hücre engulfment efferosome8, olarak adlandırdığı bir membran bağlı çarpıtması içine teşvik sinyal yolları 9 , 10 , 11 , 12. efferosome sırayla endosomes ile sigortalar ve Moleküler makineler efferosome acidify ve apoptotik aşağılamak için gerekli teslim organellerin hücre kargo13,14. Bir kez bozulmuş, apoptotik hücre kaynaklı malzemeler için geri dönüşüm endosome ticareti — bir süreç olan bağışıklık yanıtı apoptotik hücre kaynaklı antijenleri için sınırlar ve hangi apoptotik hücre13, besin kurtarma için izin verebilir 15. Engelli izni efferocytosis sonuçlarında apoptotik hücre bir başarısızlık; temizlenmemiş bu hücreler sonunda sekonder nekrozis tabi. Nekrotik hücre pro-inflamatuar sitozolik İçindekiler, patojenler ve autoantigens böylece driving range infektif, enflamatuar ve otoimmün hastalıklar16,17ekstraselüler ortamın yayın. Birlikte, apoptozis ve efferocytosis ölmek üzere olan ve ölü hücreleri kaldırılmasını kolaylaştırmak ve doku homeostazı bakım için izin.
Efferocytosis temel moleküler mekanizmaları araştıran apoptotik hücre Alım açık bir miktar sağlamak üzere yöntemler gerektirir. Bu miktar diğer alımını mekanizmaları endositoz ve fagositoz18,19, efferocytosis gibi sağlam hedef hücre, parçalı Anlamazdın kaynaklanan engulfment neden olabileceğini değil aslında tarafından karmaşıktır apoptotik hücre efferocyte20. Burada açıklanan protokolü sağlar internalized doğru tarif bir vitro efferocytosis tahlil açıklar karşı bireysel apoptotik hücre bölümleri sigara içselleştirilmiş ve sabit-hücre çeşitli ile kombine edilebilir ve Live-cep mikroskobu yaklaşımlar. Geleneksel fagositoz deneyleri eklemek antikorlar Özel Sigara içselleştirilmiş hedefleri, nerede bizim yöntemi olarak etiketlemek için deney sonunda fagositik hedefe farklı kovalent bağlı biotin21 apoptotik hedefle etiketleme , 22. apoptotik hücre belirli antikor-ebilmek var olmak kullanılmış bu tahlil ederken, biotinylation yaklaşım herhangi bir protein taşıyan hedef etiketlenmeye olanak sağlar ve immunostaining gerçekleştirilirse ikincil antikor olan ile olası sorunları önler . Özellikle, bir hücre izleme boya ve biotin ile çift lekeli edilmiştir apoptotik Jurkat hücreleri hazırlanması anahat. Boya izleme hücre efferocytosis sırasında izleniyor, efferocytosed apoptotik hücre sigara içselleştirilmiş bölümlerden ise yüzey biotinylation ayrımcılık için sağlar internalized apoptotik hücre kaynaklı malzeme sağlar. Ayrıca Kültür ve hazırlanması J774.2 ve THP-1 hücre hatları için fare ve insan efferocytes olarak kullanmak, monosit kaynaklı M2 makrofajlar birincil hücre efferocytosis ve Jurkat hücreleri kullanmak için bir örnek olarak efferocytic hedef olarak açıklar. Bu yöntemler diğer hücre hatlara veya primer hücre, hücre ölümü (Örneğin apoptosis, nekroz ve necroptosis) her türlü geçiren hedef hücrelere ve hangi apoptotik hücreler lipid kaplamalar arasında taklit mikron büyüklüğünde taklit eder kolayca uygulanabilir veya kaplama ligandlar belirli bir faiz efferocytic takımı ile.
Bu protokol için özetlenen yöntemi yaygın olarak kullanılan alan23,24akış sitometresi dayalı yöntemler üzerinde birçok avantajı vardır. NET her iki toplam ve sigara içselleştirilmiş apoptotik hücre malzemesi etiketleme ile kombine Fagosit-apoptotik hücre etkileşimi doğrudan görüntüleme tarafından efferocytosis nicel ölçüleri yapılabilir. Ayrıca, pH-duyarlı fluorophores bazı alternatif yöntemler25zihnimi karıştıran lizozomal pH FITC ve GFP floresans bastırılması gibi karıştırıcı faktörlerin kısıtlar. Son olarak, ayrıntılı olarak açıklanmıştır değil iken, bu yöntemler transgenes, fluorescently etiketli ifade efferocytes kullanarak istihdam edilebilir veya sonrası fiksasyon immunostaining molekül etkinlik sinyal ve izlenmesi miktar için izin vermek için ile hücresel süreçler sırasında efferocytosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için özetlenen yöntemleri görüntüleme ve miktar sabit-hücre ve canlı hücre yaklaşımları kullanarak dinamik efferocytic işleminin etkinleştirin. Bu yaklaşımlar yaygın istihdam akış sitometresi tabanlı yöntemleri23,24çeşitli avantajlar sunuyor. Inside-out ile sabit örnekleri boyama kullanım oranı daha sağlam ve doğru miktar ve efferocytosis kapsamı sağlar — gerçekten de, birçok akış sitometresi tabanlı yöntem sadece…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada sağlık araştırma (CIHR) işletim Grant paspas-123419, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada keşif Grant 418194 ve bir Ontario Bakanlığı araştırma ve yenilik erken Araştırma Ödülü BH için Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. DGW bazı resimler, iletişim kuralları’nın bir optimizasyon ve el yazması yazma sunulan katkıda bulunmuştur; Liverpool Üniversitesi bir pompa astar hibe tarafından finanse edildi. CY Vanier Yüksek Lisans Burs ve CIHR MD/doktora öğrencilik tarafından finanse edilmektedir. Finansmanı kuruluşları çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| RPMI 1640 Media | Wisent | 3500-000-EL | |
| DMEM Media | Wisent | 319-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| PBS | Wisent | 311-010-CL | |
| 18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72290-08 | Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture |
| Staurosporine | Cayman Chemical | 81590 | Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution) |
| Annexin V-Alexa 488 | ThermoFisher | R37174 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| CellTrace FarRed | ThermoFisher | C34572 | |
| CellTrace Orange | ThermoFisher | C34851 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| FITC-Streptavadin | ThermoFisher | SA1001 | |
| Lympholyte-poly cell sepration medium | Cedarlane Labs | CL5071 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL-4 | Peprotech | 300-25 | |
| J774.2 Macrophage Cell Line | Sigma-Aldrich | 85011428-1VL | |
| THP-1 Human Monocyte Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| Jurkat T Cell Line | ATCC | TIB-152 |
Referências
- Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
- Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
- Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
- Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
- Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
- Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
- Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
- Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
- Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
- Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529 (2016).
- Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
- Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. , 1-9 (2017).
- Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
- Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
- Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
- Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
- Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
- Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
- Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
- Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
- Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863 (1863).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
- Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
- Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
- Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
- Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
- Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
- Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
- Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
- Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
- Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
- Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004 (2012).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964 (2011).
- Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
- Nguyen, K. -. Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
- Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).
