Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide
Summary
El protocolo describe una técnica para estudiar la capacidad del primario policlonal T las células humanas para formar sinápticas interfaces con bicapas lipídicas planares. Utilizamos esta técnica para mostrar la capacidad de formación de sinapsis diferencial de las células T humanas principal derivado de los ganglios linfáticos y la sangre periférica.
Abstract
La comprensión actual de la dinámica y características estructurales de interfaces sinápticas del T-cell ha sido determinados en gran medida mediante el uso de bicapas planas basadas en cristal y en vitro-derivada de la célula de T clones o líneas1,2 ,3,4. Cómo estos resultados se aplican a las células de T humanas primarias aisladas de sangre o linfoides tejidos no se conoce, en parte debido a dificultades importantes en la obtención de un número suficiente de células para análisis5. Aquí nos dirigimos a través del desarrollo de una técnica de explotación de diapositivas de flujo multicanal para construir bicapas lipídicas planares conteniendo moléculas de activación y adhesión. La baja altura de las diapositivas de flujo promueve la sedimentación rápida de la célula para sincronizar accesorio celular: bicapa, lo que permite a los investigadores a estudiar la dinámica de la formación sináptica de la interfaz y la cinética de la liberación de los gránulos. Aplicamos este enfoque para analizar la interfaz sináptica de tan sólo 104 105 primaria criopreservados T células aisladas de los ganglios linfáticos (LN) y sangre periférica (PB). Los resultados revelan que la técnica de la bicapa de lípidos planar novela permite el estudio de las propiedades biofísicas de las células T primarias humanas derivadas de la sangre y los tejidos en el contexto de la salud y la enfermedad.
Introduction
Conocimiento científico de las características estructurales de la sinapsis inmunes T-cell y su vínculo con la actividad funcional de células T ha sido generado principalmente del estudio de líneas celulares y los clones derivado de PB. En qué medida estos resultados se refieren a las células T primarias obtenidas de sangre o tejidos linfoides humanos sigue siendo confuso, como las interfaces sinápticas de las células que residen en los tejidos linfoides y otros no han sido analizadas hasta ahora. Lo importante, los datos emergentes sugieren que reside en el tejido y derivan de órgano linfoide de las células T pueden tener diferencias en su fenotipo y su actividad funcional en comparación con aquellos en PB6,7. Esto consolidó aún más la necesidad de comprender mejor las características de la interfaz sináptica del T-cell en las células de T humanas primarias.
Para ello, hemos desarrollado un enfoque de escala mini novela explotando bicapas lipídicas soportadas en diapositivas de flujo multicanal que nos permite llevar a cabo la proyección de imagen de interfaces T-célula/bicapa con menos de 105 T las células primarias aisladas de humano PB y LN. Esta novedosa técnica permite el estudio de las propiedades biofísicas de primarias interfaces sinápticas del T-cell humanas para mejor modelo y entender en vivo las interacciones célula-célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
La nueva técnica descrita aquí utiliza reactivos similares requeridos para construir bicapas planares de la célula de flujo convencional5 y puede ser aplicada con éxito para realizar la proyección de imagen de células T humano primario – bicapa interfaces3,4 ,15. La técnica ofrece una reducción significativa en el uso de moléculas fluorescentes y requiere 10 – 20 x menos las células de T en…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la subvención del NIH R01AI118694 a Michael R. Betts, que incluye el premio 566950 a Yuri Sykulev. Agradecemos la Sidney Kimmel Cancer centro Bioimagen compartido recursos por su excelente apoyo.
Materials
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
Referências
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