Оценка синаптических интерфейса первичного человека Т-клеток в периферической крови и лимфоидной ткани
Summary
Протокол описывает метод для изучения первичного поликлональных человеческих клеток T способность образовывать синаптических интерфейсов с использованием Вселенский липидных бислоев. Мы используем этот метод, чтобы показать возможности формирования дифференциального синапса человека первичной Т-клеток, полученных из лимфатических узлов и периферической крови.
Abstract
Нынешнее понимание динамики и структурных особенностей T-клетки синаптической интерфейсов был во многом определяется с помощью стекла поддерживает планарные бислоев и в пробирке-производных Т-клеток клоны или линии1,2 ,3,4. Как эти выводы касаются первичных человеческих клеток T изолированы от крови или лимфоидной ткани, отчасти из-за значительных трудностей в получении достаточное количество клеток для анализа5не известно. Здесь мы решить эту путем разработки методики использования многоканальных потока слайды для создания Вселенский липидных бислоев содержащие активации и сцепления молекул. Низкая высота слайды потока способствует седиментации быстрого клеток для синхронизации клеток: бислой вложения, тем самым позволяя исследователей для изучения динамики формирования синаптических интерфейс и кинетика гранулы релиза. Мы применяем этот подход для анализа синаптических интерфейс как мало, как 10-4 до 105 первичных криоконсервированных Т-клетки изолированы от лимфатических узлов (LN) и периферической крови (PB). Результаты показывают, что роман Вселенский липидного бислоя техника позволяет Исследование биофизических свойств первичного человека Т-клеток, полученных из крови и тканей в контексте здоровья и болезни.
Introduction
Научные знания о структурных особенностей Т-клеток иммунной синапсов и их связь с функциональной активности Т-клеток была сформирована главным образом от изучения клеточных линий и клоны производным от PB. В какой степени эти выводы относятся к основной Т-клетки получены из крови или лимфоидной ткани человека остается неясным, как до настоящего времени не были проанализированы синаптических интерфейсов Т-клеток, проживающих в лимфоидных и других тканях. Главное новые данные показывают, что ткани резидентов и лимфоидных орган производные Т-клетки могут иметь значительные различия в их фенотипа и функциональной активности по сравнению с теми в PB6,7. Это дальнейшее затвердевших необходимость лучше понять особенности синаптических интерфейса Т-клеток в первичных человеческих клеток T.
С этой целью мы разработали подход Роман мини-масштаб использования липидных бислоев встроены в многоканальный потока слайды, что позволяет нам выполнять изображений T-клеток/бислой интерфейсов с менее чем 105 первичных Т-клетки изолированы от человеческого PB и LN. Этот роман техника позволяет Исследование биофизических свойств первичных человеческих Т-клеток синаптических интерфейсов для лучшей модели и понять в естественных условиях взаимодействия ячеек.
Protocol
Representative Results
Discussion
Роман метод, описанный здесь использует аналогичные реагентов, необходимых для построения плоской бислоев в поток обычных клеток5 и может успешно применяться для выполнения визуализации первичных человеческих клеток T – бислой интерфейсов3,4 <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом R01AI118694 низ для Майкл р. Беттс, которая включает премию суб 566950 Юрий Sykulev. Мы благодарим Сидни Киммел рак центра Bioimaging общий ресурс за их прекрасную поддержку.
Materials
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
Referências
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
- Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
- Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
- Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
- Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
- Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
- Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
- Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
- Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
- Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
- Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
