Vurdering av Synaptic grensesnittet av primære menneskelige T-celler fra perifert blod og lymfoidvev
Summary
Protokollen beskriver en teknikk for å studere evne til primære polyklonale menneskelige T celler å danne synaptic grensesnitt ved hjelp av Plane lipid bilayers. Vi bruker denne teknikken til å vise differensial synapse formasjon evnen til menneskelig primær T-celler avledet fra lymfeknuter og perifert blod.
Abstract
Den nåværende forståelsen av dynamikken og strukturfunksjonene T-celle synaptic grensesnitt er i stor grad bestemt bruk av glass-støttet ut bilayers og i vitro-avledet T-celle kloner eller linjer1,2 ,3,4. Hvordan disse resultatene gjelder de primære menneskelige T cellene isolert fra blod eller lymfoid vev er ikke kjent, delvis på grunn av betydelige vanskeligheter å skaffe et tilstrekkelig antall celler for analyse5. Her ta vi dette gjennom utvikling av en teknikk utnytte flerkanals flyt lysbilder for å bygge ut lipid bilayers som inneholder aktivere og vedheft molekyler. Den lave høyden flyt lysbildene fremmer rask celle sedimentering synkronisere celle: bilayer vedlegg, og dermed slik at forskere til å studere dynamiske av synaptic grensesnitt dannelse og the kinetics av granulater utgivelsen. Vi bruker denne tilnærmingen å analysere synaptic grensesnittet for så lite som 104 til 105 primære cryopreserved T celler isolert fra lymfeknuter (LN) og perifert blod (PB). Resultatene viser at romanen planar lipid bilayer teknikken muliggjør studiet av Biofysiske egenskapene for primær menneskelige T-celler avledet fra blod og vev i forbindelse med helse og sykdom.
Introduction
Vitenskapelig kunnskap om strukturfunksjonene T-celle immun synapser og deres link til den funksjonelle aktiviteten i T-celler er generert hovedsakelig fra studiet av linjer og kloner avledet fra PB. Til hvilken grad disse funnene knyttet til primær T-celler Hentet fra blod eller menneskelig lymfoid vev er fortsatt uklart, som synaptic grensesnittene av T-celler i lymfoide og andre vev ikke har analysert så langt. Viktigere, tyder nye data på at vev-resident og lymfoide organ-avledet T celler kan ha betydelige forskjeller i fenotypen og funksjonelle aktiviteten sammenlignet med de i PB6,7. Dette er ytterligere styrket behovet for å forstå funksjonene i T-celle synaptic grensesnittet i primær menneskelige T-celler.
Dette har vi utviklet en ny mini skala tilnærming utnytte lipid bilayers bygget i flerkanals flyt lysbilder slik at vi kan utføre avbilding av T-celle/bilayer grensesnitt med mindre enn 105 primære T celler isolert fra menneskelige PB og LN. Denne teknikken tillater studiet av Biofysiske egenskapene til primære menneskelige T-celle synaptic grensesnitt for å bedre modell og forstå i vivo celle-celle interaksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikken beskrevet her benytter lignende reagenser kreves for å bygge ut bilayers i konvensjonelle flyt celle5 og kan bli brukt for å utføre avbilding av primære menneskelige T celle-bilayer grensesnitt3,4 ,15. Teknikken tilbyr en betydelig reduksjon i fluorescerende molekyler bruken og krever 10-20 x færre T celler i forhold til en flyt cellen systemet5, skape mulighet til …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av R01AI118694 NIH stipend til Michael R. Betts, som inkluderer sub pris 566950 til Yuri Sykulev. Vi takker Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging delte ressursen for deres utmerket støtte.
Materials
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
Referências
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
- Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
- Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
- Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
- Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
- Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
- Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
- Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
- Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
- Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
- Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
