परिधीय रक्त और लसीकावत् ऊतक से प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के Synaptic इंटरफेस का आकलन
Summary
प्रोटोकॉल planar लिपिड bilayers का उपयोग synaptic इंटरफेस फार्म करने के लिए प्राथमिक polyclonal मानव टी कोशिकाओं की क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक तकनीक का वर्णन. हम मानव प्राथमिक टी लिम्फ नोड्स और परिधीय रक्त से व्युत्पंन कोशिकाओं के अंतर synapse गठन की क्षमता दिखाने के लिए इस तकनीक का उपयोग करें ।
Abstract
टी सेल synaptic इंटरफेस की गतिशीलता और संरचनात्मक सुविधाओं की वर्तमान समझ मोटे तौर पर कांच के उपयोग के माध्यम से निर्धारित किया गया है समर्थित planar bilayers और इन विट्रो-व्युत्पन्न टी सेल क्लोन या लाइनों1,2 ,3,4. कैसे इन निष्कर्षों प्राथमिक मानव टी रक्त या लसीकावत् ऊतकों से अलग कोशिकाओं को लागू करने के लिए जाना जाता है, आंशिक रूप से5विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या प्राप्त करने में महत्वपूर्ण कठिनाइयों के कारण नहीं है । यहां हम एक मल्टीचैनल प्रवाह स्लाइड का दोहन planar लिपिड सक्रिय और आसंजन अणुओं युक्त bilayers का निर्माण करने के लिए एक तकनीक के विकास के माध्यम से पता । प्रवाह स्लाइड की कम ऊंचाई क्रम में तेजी से सेल अवसादन को बढ़ावा देने के लिए सेल सिंक्रनाइज़: bilayer लगाव है, जिससे शोधकर्ताओं synaptic इंटरफेस गठन और granules रिलीज के कैनेटीक्स के गतिशील अध्ययन करने की अनुमति । हम के रूप में कुछ के रूप में 104 से 105 प्राथमिक cryopreserved टी कोशिकाओं लिम्फ नोड्स (LN) और परिधीय रक्त (पंजाब) से पृथक की synaptic इंटरफेस का विश्लेषण करने के लिए इस दृष्टिकोण लागू होते हैं । परिणामों से पता चलता है कि उपन्यास planar लिपिड bilayer तकनीक स्वास्थ्य और रोग के संदर्भ में रक्त और ऊतकों से प्राप्त प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के भौतिक गुणों के अध्ययन में सक्षम बनाता है ।
Introduction
टी सेल की संरचनात्मक सुविधाओं के वैज्ञानिक ज्ञान प्रतिरक्षा synapses और टी कोशिकाओं के कार्यात्मक गतिविधि के लिए उनके लिंक मुख्य रूप से सेल लाइनों और पंजाब से व्युत्पंन क्लोन के अध्ययन से उत्पंन किया गया है । किस हद तक इन निष्कर्षों प्राथमिक टी रक्त या मानव लसीकावत् ऊतकों से प्राप्त कोशिकाओं से संबंधित है अस्पष्ट बनी हुई है, टी लसीकावत् और अंय ऊतकों में रहने वाले कोशिकाओं के synaptic इंटरफेस के रूप में इस प्रकार अब तक विश्लेषण नहीं किया गया है । महत्वपूर्ण रूप से, उभरते आंकड़ों का सुझाव है कि ऊतक निवासी और लसीकावत्-अंग-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं उनके phenotype और कार्यात्मक गतिविधि में महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है उन की तुलना में पीबी6,7. इससे आगे प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में टी-सेल synaptic इंटरफेस की सुविधाओं को बेहतर ढंग से समझने की जरूरत जम गई है.
इस अंत करने के लिए, हम एक उपंयास मिनी पैमाने पर विकसित किया है लिपिड bilayers का दोहन मल्टीचैनल प्रवाह स्लाइड में निर्मित हमें सक्षम करने के लिए टी के इमेजिंग-सेल/bilayer से कम 105 प्राथमिक टी कोशिकाओं के साथ इंटरफेस मानव पंजाब और LN से अलग । यह उपंयास तकनीक प्राथमिक मानव टी सेल synaptic इंटरफेस के भौतिक गुणों के अध्ययन के क्रम में बेहतर मॉडल और vivo सेल सेल बातचीत में समझने की अनुमति देता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
उपंयास तकनीक यहां वर्णित इसी तरह का उपयोग करने के लिए पारंपरिक प्रवाह सेल5 में planar bilayers बनाने और सफलतापूर्वक प्राथमिक मानव टी सेल के इमेजिंग-bilayer इंटरफेस3,4 प्रदर्शन के लिए लागू किया ज?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम माइकल आर Betts को R01AI118694 NIH अनुदान द्वारा समर्थित था, जिसमें यूरी Sykulev को उप-पुरस्कार ५६६९५० शामिल है । हम उनके उत्कृष्ट समर्थन के लिए सिडनी Kimmel कैंसर केंद्र को साझा संसाधन का धंयवाद ।
Materials
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
Referências
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