Un ensayo In Vitro para detectar actividad de transferasa de Isopentenyl tRNA

Se han identificado al menos 163 distinta modificación postranscripcional de RNA, con estas modificaciones confieren funciones diversas y contextual para RNAs directamente influir en la estructura del RNA y que afectan a las interacciones de RNA con otros las moléculas^1,2. A medida que aumenta la apreciación de la cantidad y variedad de modificaciones de RNA, es fundamental para desarrollar ensayos que pueden interrogar confiablemente las modificaciones del RNA y las enzimas que catalizan los.

Una de las primeras modificaciones de RNA para identificarse se produce en 37 base en tRNAs, adyacente al anti-codon en el 3′ parte^3,4. Un grupo de isopentenyl se transfiere del dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) en la posición N6 de la adenosina 37 (me⁶A37) ^3,5 en un subconjunto de tRNAs citoplásmica y mitocondrial. i⁶A37 mejora la fidelidad de la traducción y eficiencia aumentando la afinidad del ARNt por el ribosoma^4,6 y yo⁶A37 es importante para la respuesta de estrés en las bacterias⁷. Las enzimas que realizan esta modificación se denominan transferasas de isopentenyl tRNA y están muy conservadas en bacterias^8,9, hongos¹⁰, gusanos¹¹, plantas¹²y eucariotas superiores¹³ , incluyendo los seres humanos¹⁴.

Las mutaciones en el gene humano de tRNA isopentenyl transferasa, TRIT1, están asociadas con enfermedad humana. Por ejemplo, una mutación en el TRIT1 se correlaciona con una severa enfermedad mitocondrial, probablemente causada por un defecto en la síntesis de proteínas mitocondriales^15,16. Además, TRIT1 ha sido descrito como un tumor supresor genes^17,18 y está implicada en varios tipos de cáncer incluyendo melanoma¹⁹, mama²⁰, gástrico²¹y cánceres de pulmón^{22 ,23}. Finalmente, TRIT1 y Mod5 transferasas de isopentenyl (Saccharomyces cerevisiae) son propensas a la agregación de proteínas que forman las fibras de amiloide-como prión^24,25,26. Estas observaciones implican potencialmente transferasas de isopentenyl tRNA en enfermedades neurodegenerativas, aunque todavía no se ha demostrado evidencia directa para esto.

Dado el papel que isopentenyl transferasas en traducción y la enfermedad, métodos que directamente me miden⁶una actividad de transferasa de isopentenyl son importantes para una comprensión mecanicista de estas enzimas bajo normal y Estados de la enfermedad. Un número creciente de métodos está disponible para detectar modificaciones de una RNA⁶, incluyendo en vitro isopentenylation ensayos, hibridación positivo en ausencia de⁶ensayos (PHA6), delgada cromatografía (TLC), aminoácido ensayos de actividad de aceptación y métodos de espectrometría de masas (revisado en Ref. ⁴).

Un ensayo de isopentenylation en vitro se ha descrito que utiliza ¹⁴C-DMAPP y tRNAs sin etiqueta. En este ensayo, carbono radiactivo se transfiere al ARN de ¹⁴C-DMAPP por la transferasa de isopentenyl. Mientras que este ensayo es altamente sensible, a menudo es difícil determinar el residuo concreto que es modificada^9,20,27. PHA6 ensayos dependen de la voluminosa me modificación⁶A interferir con la hibridación de una sonda marcada con P ³², que abarca el residuo modificado. Como tal, la hibridación es mayor en la ausencia de una i⁶una modificación^18,28,29. PHA6 ensayos son muy sensibles y capaces de análisis de ARN total extraído de Lisados celulares. Además, la habilidad de diseñar sondas específicas de RNA de interés ofrece esta flexibilidad de método objetivo sustancial. Sin embargo, ensayos de PHA6 se limitan a la caracterización de las modificaciones que se producen en los residuos dentro de la región específica de la sonda y por lo tanto son menos propensos a identificar sitios de modificación novedosa. Además, como falta de Unión es indicativa de la modificación, otras modificaciones o mutaciones que afectan la Unión de la RNA se confundir análisis de datos.

Otro enfoque combina cromatografía de celulosa bencílico DEAE celulosa (BD) con actividad de aceptación de aminoácidos como una lectura de lo⁶A modificaciones en el tRNA³⁰. Este enfoque ensayos directamente la función de la i modificación de⁶A, pero es una aproximación indirecta a detectar i⁶A modificación y carece de resolución para mapear modificaciones a un residuo específico en el ARN. Un enfoque del TLC se ha utilizado para detectar total tRNA i⁶A modificaciones. En este enfoque, internamente ³²tRNAs P etiquetados son digeridos a nucleótidos individuales y análisis TLC bidimensional se utilizan para identificar el isopentenylation. Este enfoque es altamente sensible en la detección de i total⁶A en una muestra determinada de RNA pero sobre digestión, toda la información de secuencia se pierde; así, el investigador no tiene forma de determinar que los residuos han sido modificados³¹.

Más recientemente, se han desarrollado métodos líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) que comparar cuantitativamente la total modificación de RNA entre especies, tipos celulares y condiciones experimentales^{32,33, 34}. Una limitación de esta metodología es que es menos capaz de determinar la identidad y posición en el ARN que los nucleósidos modificados fue derivan³⁴. Además, la experiencia y el equipo necesario para ejecutar estos experimentos limitan la utilidad de este enfoque.

Además, se han desarrollado varias tecnologías de secuenciación de próxima generación para RNA modificaciones todo el transcriptoma³⁴. Inmunoprecipitación de RNAs con anticuerpos específicos a una modificación especial (RIP-Seq) permiten al investigador a identificar todas las secuencias que contiene una modificación específica^35,36. Además, enfoques basados en la transcriptasa reversa como Chem-Seq y secuencia del desajuste no aleatoria se basan en las perturbaciones de la reacción de transcripción inversa en los residuos modificados^37,38,39. A pesar de la ventaja de estas técnicas para asignar todo el RNA modificaciones transcriptoma, RIP-seq y Chem-Seq tecnologías están limitadas por la falta de anticuerpos confiables o disponible para cada modificación específica, respectivamente³⁴reactivos químicos. Además, las enzimas transcriptasa reversa necesaria para realizar Chem-Seq y técnicas de secuenciación de desajuste no aleatoria pueden verse obstaculizadas por las estructuras de RNA estables. La naturaleza altamente modificada y estructuralmente estable de tRNAs hacen especialmente difíciles de interrogar utilizando estas técnicas. Hasta la fecha, tecnologías de secuenciación de próxima generación no se han utilizado todavía para mapa i⁶una modificaciones³⁴.

Adjunto, describimos un enfoque simple y directo detectar⁶un tRNA modificaciones in vitro. Este método utiliza incubación de RNAs con recombinante S. cerevisiae isopentenyl transferasa (Mod5), seguido por digestión Rnasa T1 y el análisis de electroforesis de gel de 1 dimensión para mapa i⁶A modificaciones. Este enfoque es directo y requiere poco especializados para analizar los datos. Además, este método es adaptable a otros RNA modificación de enzimas, incluyendo enzimas que modifican covalentemente el peso molecular del ARN o movilidad de un RNA a través de un gel.