JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Visualiseren van genetische varianten, korte doelen en puntmutaties in het kader van de morfologische weefsel met een RNA In Situ hybridisatie Assay

Published: August 14, 2018
doi:
10.3791/58097
, , , , , , , , , ,
1Advanced Cell Diagnostics, Inc

Summary

Hier beschrijven we een in situ hybridisatie bepaling waarmee gevoelige en specifieke detectie van sequenties 50 nucleotiden met single-nucleotide resolutie op het niveau van eencellige zo kort. De assay, die kan worden uitgevoerd, handmatig of automatisch, kunt inschakelen visualisatie van splice varianten, korte reeksen en mutaties in het kader van het weefsel.

Abstract

Omdat precisie geneeskunde sterk afhankelijk van de nauwkeurige detectie van biomarkers is, is er een toenemende behoefte aan gestandaardiseerde en robuuste technologieën die RNA biomarkers in situ in klinische monsters meten. Terwijl sleur-en-bind assays zoals RNAseq en kwantitatieve RT-PCR inschakelen hooggevoelige gen expressie metingen, ze ook vereisen RNA extractie en daarmee te voorkomen dat waardevolle expressie analyse in het kader van de morfologische weefsel. De in situ hybridisatie (ISH) bepaling die hier worden beschreven kunt detecteren RNA doel sequenties 50 nucleotiden op single-nucleotide resolutie en de eencellige niveau zo kort. Deze bepaling vormt een aanvulling op de eerder ontwikkelde commerciële assay en maakt gevoelige en specifieke in situ detectie van splice varianten, korte doelen en puntmutaties binnen het weefsel. In dit protocol, werden sondes ontworpen om te richten van unieke exon kruispunten voor twee klinisch belangrijk splice varianten, EGFRvIII en METΔ14. De detectie van korte doel sequenties werd aangetoond door de specifieke detectie van CDR3 sequenties van T-cel-receptoren α en β in de Jurkat T-cel-lijn. Ook komt te staan is het nut van deze ISH assay voor het onderscheid van RNA opeenvolgingen van de target op single-nucleotide resolutie (puntmutaties) door de visualisatie van EGFR L858R en G12A van de KRAS single-nucleotide variaties in cellijnen met behulp van geautomatiseerde kleuring platformen. Kortom bevat het protocol een gespecialiseerde RNA ISH assay waarmee de opsporing van splice varianten, korte reeksen en mutaties in situ voor handmatige prestaties en geautomatiseerde stainers.

Introduction

High-throughput transcriptomic technologieën zoals microarrays en volgende-gen RNA sequencing (RNAseq) zijn de ontdekking van RNA biomarkers met voorspellende, diagnostische en prognostische klinische waarde voor verschillende ziekten waaronder exponentieel verbeterd kanker1,2. Om verder te gaan van het gebruik van deze biomarkers in precisie geneeskunde, is er een hoge behoefte aan gestandaardiseerde en robuuste technologieën die RNA biomarkers in het kader van het weefsel van klinische monsters kunnen meten. Terwijl grote schaal vastgesteld sleur-en-bind assays zoals RNAseq en kwantitatieve RT-PCR inschakelen hooggevoelige gen expressie metingen, de vereiste weefsel homogenisering en RNA isolatie impliceren het verlies van in vivo celtype specificiteit en morfologische informatie3. Conventionele in situ RNA detectie methoden ontbreken de gevoeligheid en specificiteit die zijn vereist voor het betrouwbaar meten van zeldzame of lage-uiten RNA biomarkers binnen de weefsel kader4.

Een commerciële in situ hybridisatie (ISH) assay (bv., de RNAscope-assay) is een technologie die heeft beziggehouden deze uitdagingen en maakt het ook mogelijk de zeer gevoelige en specifieke visualisatie van afzonderlijke RNA-moleculen die groter is dan 300 nucleotiden in het weefsel morfologische kader. Dit type van test gebruikt een unieke oligonucleotide sonde ontwerp van ongeveer 6 – 20 dubbel-Z sonde paren gecombineerd met een geavanceerde hybridisatie gebaseerde signaal versterking5.

Deze studie beschrijft een gespecialiseerde RNA ISH assay, BaseScope, complementair aan de eerder ontworpen commerciële technologie die RNA doel sequenties 50 nucleotiden bij één nucleotide resolutie zo kort detecteren kan. Deze test behandelt de ingewikkelde complexiteit van transcriptome en geldt voor de nauwkeurige detectie van puntmutaties in het weefsel kader (tabel 1) met behulp van zo weinig zoals één dubbel-Z sonde paar exon kruispunten en korte doel sequenties. Dit verslag toont het volledige assay-protocol en het gebruik ervan in de opsporing van splice varianten, CDR3 reeksen voor T-cel receptor klonen, en één-nucleotide mutaties in FFPE cel lijnen en tumor weefsels.

Protocol

De monsters van de menselijke tumor gebruikt in deze studie werden deidentified en verkregen uit commerciële bronnen overeenkomstig de plaatselijke ethische richtsnoeren voor menselijke onderzoek. 1. steekproef, apparatuur en bereiding van het reagens Bereiding van de monsters van de FFPE Weefsels Onmiddellijk na dissectie, corrigeer het weefsel (snijd in blokjes van 3 – 4 mm in dikte) in 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) 16-32 uur bij kamertemperatuur (RT).Opmerking: Fixatie tijd zal variëren afhankelijk van weefseltype en grootte. Wassen van het monster met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en uitdrogen met behulp van een reeks standaard ethanol (EtOH) (70% EtOH voor 30-60 min, 80% EtOH voor 30-60 min, 90% EtOH voor 30-60 min, 95% EtOH voor 30-60 min, 3 x 100% voor EtOH 30-60 min) gevolgd door xyleen. Het monster inbedden in paraffine met behulp van standaardprocedures6 en trim de paraffineblokken desgewenst verwijderen overtollige paraffine.Opmerking: Blokgrootte hangt af van de grootte van de steekproef van het weefsel, maar een typische grootte is 0,75 x 0,75 inch2 of kleiner. Cellijnen Verzamelen- and -pellet cellen volgens de aanbevolen methodes voor de specifieke mobiele lijn. Fix cellen in 10% formaldehyde bij RT gedurende 24 uur op een rotator. Bereiden van cellen als een pellet in voorverwarmde verwerking gel (bv., Histogel). Toestaan dat de pellet te stollen door het plaatsen van de gel-cel pellet op een stuk van parafilm op ijs en laat het zitten voor 2 – 3 min. Submerge de gel-cel pellet in 1 x PBS. Dehydrateren en inbedden van de cel-pellets zoals beschreven in stap 1.1.1. Sectie voorbereiding Snijd de ingesloten weefsels/cellen in 5 ± 1 μm delen gebruikend microtome, mount de secties op elektrostatisch zelfklevende glas dia’s en drogen ze ‘s nachts op RT.Opmerking: De dia’s kunnen worden achtergelaten bij RT onder uitdroging voor maximaal 3 maanden. Plaats van de dia’s in een dia-rack en bak de gemonteerde weefsel dia’s in een circulerende lucht oven op 60 ° C gedurende 1 uur voordat u de test uitvoert.Opmerking: De dia’s onmiddellijk gebruik of bewaar ze bij RT met droogmiddelen voor maximaal 1 week. Langdurige opslag kan resulteren in de aantasting van het RNA. Voorbereiding van de apparatuur Stel de kruising oven op 40 ° C. Grondig de luchtbevochtiging papier NAT verwijderen van alle resterende dH2O. invoegen het papier in de lade van de control vochtigheid en schuif de lade in de oven hybridisatie aan prewarm gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik. Bereiding van het reagens Vul twee clearing agent gerechten met 200 mL xyleen en vul twee kleuring gerechten met 200 mL 100% EtOH, die zal worden gebruikt voor deparaffinization van secties. 200 mL verkrijgbare 1 x doel ophalen reagens voor te bereiden door toevoeging van 180 mL dH2O tot 20 mL 10 x doel ophalen reagens. Plaats twee dia houders in een stoomboot. Vul één dia houder met 200 mL 1 x doel ophalen reagens en vul de andere dia houder met 200 mL dH2O. warmte beide oplossingen aan de kook met de steamer. Warme 50 x was buffer tot 40 ° C voor 10 – 20 min. bereiden 3 L van 1 x wassen buffer door 60 mL verdunnen voorverwarmde 50 x was buffer met 2.94 L van dH2O. Bereiden in een zuurkast, 50% Gill Haematoxyline oplossing door toevoeging van 100 mL Gill Haematoxyline tot 100 mL van dH2O. counterstaining Bereiden in de zuurkast, blauwsel reagens (0,02% (m/v) ammoniak water) door toevoeging van 1,43 mL ammoniumhydroxide 28-30% tot 250 mL van dH2O. Prewarm doel sondes bij 40 ° C gedurende 10 minuten vóór de kruising van de sonde en de uitdeinende reagentia (AMP 0 – 6) brengen RT. 2. RNA In Situ hybridisatie Assay Deparaffinization en uitdroging Na het bakken zoals beschreven in stap 1.1.3.2 (optionele stopplaats 1), deparaffinize van de secties in xyleen voor 5 min met agitatie. Deparaffinize weer in vers xyleen voor 5 min. Dehydrate in 100% EtOH gedurende 2 minuten met agitatie, en herhaal opnieuw in vers 100% EtOH gedurende 2 minuten. Lucht drogen van de dia’s gedurende 5 minuten bij 60 ° C in een circulerende lucht oven of op RT totdat ze volledig droog (optionele stopplaats 2). Monster voorbehandelingen Incubeer de secties met ~ 4 druppels van kant-en-klare waterstofperoxide voor 10 min op RT om quench de endogene peroxidase-activiteit. Giet de oplossing van de dia’s af en spoel ze tweemaal met dH2O. Incubeer de secties met 200 mL van het doel ophalen reagens voor 15-30 min. bij 100 ° C in een stoomboot.Opmerking: Incubatietijd kan variëren afhankelijk van weefseltype. In dit protocol werd target ophalen uitgevoerd gedurende 15 minuten staan voor zowel de monsters van de tumor en de cel pellets. Decanteren in de oplossing van de dia’s, spoel tweemaal met dH2O, duik in 100% EtOH voor 3 min en droog de dia’s op 60 ° C in een circulerende lucht oven of RT totdat volledig droog. Teken een hydrofobe barrière rond de sectie met een hydrofobe pen, ongeveer 0,75 x 0,75 inch2.Opmerking: Het is niet aanbevolen om het trekken van een kleinere barrière. Voor grotere secties, zal een grotere belemmering moeten worden getrokken. Laat de barrière 1 min volledig drogen of laat ‘s nachts op RT (optionele stopplaats 3). Plaats de dia’s in een dia houder en plaats de houder van de dia in het Dienblad van de controle van vochtigheid. ~ 4 druppels Protease III aan elke dia toevoegen en hen Incubeer gedurende 15 tot 30 min bij 40 ° C in de oven van de kruising voor de vertering van de eiwitten.Opmerking: Incubatietijd kan variëren afhankelijk van het weefseltype. In dit protocol, werd protease spijsvertering uitgevoerd voor 30 min. voor tumor monsters en 15 min voor cel pellets. Giet de oplossing van de dia’s af en spoel ze tweemaal met dH2O. Sonde hybridisatie Voeg ~ 4 druppels van de oplossing van de juiste kant-en-klare sonde ter dekking van de gehele sectie. Als grotere secties gebruikt, voeg ~ 5 – 6 druppels. De sondes voor 2 h bij 40 ° C in de oven hybridisatie te vermengen. Decanteren in de oplossing van de dia’s en wassen van de dia’s in 200 mL 1 x wassen buffer voor 2 min op RT met af en toe roeren. Herhaal de procedure wassen in deze stap. Signaal versterking Incubeer de secties met ~ 4 druppels van AMP 0 per dia bij 40 ° C in de kruising oven voor 30 min. Decant de oplossing en wassen van de dia’s in 200 mL 1 x wassen buffer voor 2 min op RT met af en toe roeren. Herhaal de procedure wassen in deze stap. Incubeer de secties met ~ 4 druppels van AMP 1 per dia bij 40 ° C in de oven hybridisatie voor 15 min. Decant de oplossing en wassen van de dia’s in 200 mL 1 x wassen buffer voor 2 min op RT met af en toe roeren. Herhaal de procedure wassen. Incubeer de secties met ~ 4 druppels van AMP 2 per dia bij 40 ° C in de kruising oven voor 30 min. Decant de oplossing en wassen van de dia’s in 200 mL 1 x wassen buffer voor 2 min op RT met af en toe roeren. Herhaal de procedure wassen. Incubeer de secties met ~ 4 druppels van AMP 3 per dia bij 40 ° C in de kruising oven voor 30 min. Decant de oplossing en wassen van de dia’s in 200 mL 1 x wassen buffer voor 2 min op RT met af en toe roeren. Herhaal de procedure wassen. Incubeer de secties met ~ 4 druppels van AMP 4 per dia bij 40 ° C in de oven hybridisatie voor 15 min. Decant de oplossing en wassen van de dia’s in 200 mL 1 x wassen buffer voor 2 min op RT met af en toe roeren. Herhaal de procedure wassen. Incubeer de secties met ~ 4 druppels van AMP 5 per dia op RT voor 30 min. Decant de oplossing en wassen van de dia’s in 200 mL 1 x wassen buffer voor 2 min op RT met af en toe roeren. Herhaal de procedure wassen. Incubeer de secties met ~ 4 druppels van AMP 6 per dia op RT voor 15 min. Decant de oplossing en wassen van de dia’s in 200 mL 1 x wassen buffer voor 2 min op RT met af en toe roeren. Herhaal de procedure wassen. Signaal detectie De snel rode kleurstof werkoplossing voor te bereiden. Voor één dia met een 0,75 x 0,75 inch2 barrière, voeg 2 μL van de kleurstof snel rood-B aan 120 μL van Fast rood-A in een buis en meng goed.Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de hydrofobe barrière en het aantal dia’s, volumes van de werkoplossing snel rood zal verschillen. De overtollige vloeistof uit de dia’s decanteren en de snel rode kleurstof werkoplossing aan dia’s toevoegen. Incubeer de dia’s gedurende 10 minuten op RT in de tray met een deksel om te voorkomen dat blootstelling aan licht.Opmerking: Gebruik het snel rood werkoplossing binnen 5 min van voorbereiding, en stel het niet bloot aan direct zonlicht of UV-licht. Decanteren in de oplossing snel rood en spoel de dia’s tweemaal met leidingwater. Plaats die de dia’s terug in een dia-rack. Counterstaining Counterstain de weefselsecties met 50% Gill Haematoxyline oplossing voor 2 min op RT. Wash de dia’s met leidingwater en herhaal dit meerdere malen totdat de dia’s duidelijk zijn, terwijl de secties paarse blijven. Dompel de dia’s in 0.02% ammoniak water voor blauwsel (dompel 2 tot 3 keer). Vervang de ammoniak water met leidingwater en wassen van de dia’s 3 tot 5 keer. Schuif montage Droog de dia’s in een circulerende lucht oven bij 60 ° C gedurende 15 minuten of bij RT totdat volledig droog. Plaats 1-2 druppels montage reagens op elke dia en plaats coverslips op elke sectie. Overlapping van luchtbellen vermijden. Lucht drogen de dia’s voor minstens 5 min.Opmerking: Het snel rood substraat is alcohol-gevoelig. Niet uitdrogen van de dia’s in alcohol. Visualisatie Let op de dia’s onder een standaard helderveld Microscoop.

Representative Results

De in situ hybridisatie assay workflow:De werkstroom is afgebeeld in Figuur 1 en bestaat uit vier delen: permeabilization van cellen of weefsels met doel ophalen en protease oplossingen, kruising van de sondes naar het doel RNA, signaal versterking, en visualisatie van het signaal. Het signaal kan ook worden gekwantificeerd aan de hand digitale imaging softwaresystemen of in een semi-kwantitatieve wijze op basis van het aantal dots per cel. De handmatige procedure die is beschreven in Figuur 2 is ook volledig geautomatiseerd in commerciële auto-kleuring systemen. Representatieve kleuring voor exon junction detectie (EGFRvIII splice variant): EGFRvIII is een variant van de epidermale groeifactor receptor die voortvloeit uit een genomic schrapping van in-frame van exons 2 tot en met 7, leidt tot constitutively actieve oncogene signalering7 . De bepaling werd gebruikt voor het identificeren van de status van de EGFRvIII in FFPE glioblastoma (GBM) tumor monsters. Één dubbel-Z sondes werden ontworpen om het beslaan van de exon kruispunten oog op de opsporing van beide WT, mutant, of beide afschriften (figuur 3A). De sondes WT EGFR beslaan de kruispunten van de exons 1 en 2 (E1/E2) of exons 7 en 8 (E7/E8), terwijl de EGFRvIII-specifieke sondes beslaan het kruispunt van de exons 1 en 8 (E1/E8). Een gemeenschappelijk sonde die het kruispunt van de exons 8 en 9 (E8/E9 omspant) werd ook gebruikt voor het detecteren van totale EGFR (zowel EGFRvIII als WT afschriften). Alle de sondes werden vervolgens gebruikt om EGFR status in FFPE GBM monsters te bepalen. De twee representatieve voorbeelden getoond in figuur 3B werden genomen uit een grotere studie. EGFR status werd bevestigd door een onafhankelijke methode, RT-PCR. Beide sondes WT ontdekt signaal in beide monsters, die aangeeft dat de twee steekproeven express WT EGFR (figuur 3B). De mutant sonde toonde echter alleen signaal detectie in het EGFRvIII + monster, bevestigen dat in dit voorbeeld inderdaad positief voor de EGFRvIII-variant (figuur 3B, linker panelen is). Daarentegen heeft de mutant sonde niet signaal gedetecteerd in de EGFRvIII-monster (figuur 3B, juiste panelen). Samen genomen, deze resultaten tonen aan dat de exon junction assay EGFRvIII status in GBM FFPE tumor monsters kan identificeren. Vertegenwoordiger kleuring voor korte doelen:De CDR3, of aanvullende bepalende gebied 3, is een zeer variabel domein in T-cel-receptoren. De volgorde van de CDR3 zijn meestal vrij kort; bijvoorbeeld, de CDR3 α en β-sequenties van de Jurkat T-cel-lijn 51 en 48 nucleotiden in lengte, respectievelijk zijn (figuur 4A). Identificeren van de specifieke opeenvolgingen van CDR uitgedrukt in Jurkat cellen, antisense sondes voor CDR3 α en β die worden uitgedrukt in de Jurkat T-cel-lijn werden gegenereerd, naast gevoel sondes voor CDR3 α en β als negatieve controle sondes. Alle de sondes werden vervolgens getest in FFPE-bereid Jurkat cellen met de test. Robuuste kleuring werd waargenomen met anti-zin sondes voor beide CDR3 α en β in de Jurkat cellen, overwegende dat gevoel sondes ontdekte weinig tot geen signaal (figuur 4B). Deze resultaten tonen aan het vermogen van de korte doel bepaling te onderscheiden van zeer variabele maar korte CDR reeksen voor T-cel receptor klonen. Vertegenwoordiger kleuring voor punt mutatie EGFR L858R:Punt mutatie sondes werden ontwikkeld om het detecteren van één nucleotide variaties en kleine invoegingen of verwijderingen (microdeleties) in het kader van de tumor. Figuur 5A toont de mogelijkheid voor in situ detectie van de punt mutatie EGFR L858R (2573T > G). Twee sondes zijn ontworpen: een om op te sporen van de L858R gemuteerd EGFR reeks en een ander om te ontdekken de EGFR L858 WT-reeks. Beide sondes werden getest in twee FFPE-bereid cellijnen: H2229, die alleen EGFR L858 WT spreekt; en H1975, die heterozygoot voor de EGFR L858R mutatie is. De mutant sonde van L858R ontdekt signaal alleen in de cellijn van H1975 maar niet in de lijn van de cel H2229. Echter, de sonde WT detecteerden signaal in beide cellijnen. Evenzo figuur 5B visualiseert in situ detectie van de punt mutatie KRAS G12A (35 G > C). Twee sondes waren ontworpen voor het opsporen van de KRAS G12A MT en KRAS G12 WT sequenties en vervolgens getest op de HuT78-cellijn (die alleen spreekt KRAS G12 WT) en de cellijn van SW116 (dat is heterozygoot voor de KRAS G12A mutatie). Terwijl de KRAS G12 WT sonde signaal in beide cellijnen waargenomen, de KRAS G12A sonde alleen signaal gedetecteerd in de lijn van de cel SW116. Samen genomen, tonen deze gegevens de technische bekwaamheid van de punt mutatie assay voor het opsporen van één nucleotide polymorphisms in de cel- en weefseltransplantaties context. Vertegenwoordiger voor de geautomatiseerde in situ -assay kleuring:Geautomatiseerde testen staan toe dat een groter aantal monsters worden uitgevoerd meer betrouwbaar, variabiliteit tussen gebruiker en hands-on tijd worden geminimaliseerd en het genereren van consequent reproduceerbare resultaten. Daarom is een geautomatiseerde versie van de test werd ontwikkeld. Om aan te tonen geautomatiseerde kleuring met deze test, werd detectie van de splice variant METΔ14 onderzocht. Deze variant is het resultaat van de exon 14 in de BMO-gen tijdens pre-mRNA-splicing, wat tot constitutieve activering en oncogene transformatie van de BMO receptor8,9 leidtwordt overgeslagen. U wilt specifiek opsporen de METΔ14 variant, twee exon junction sondes zijn ontworpen: een die omspant het kruispunt van de exons 13 en 15 (E13/E15) om op te sporen van de METΔ14 variant transcript, en een andere die omspant het kruispunt van de exons 14 en 15 (E14/E15) om te ontdekken de WT ONTMOETTE Transcript (figuur 6A). Beide sondes vervolgens in 2 FFPE-bereid cellijnen werden getest: H596, die spreekt van de variant van de METΔ14, en A549, die spreekt van het gen WT ONTMOETTE. Beide sondes toonde uitsluiten-expressiepatronen, met de E13/E15-sonde detecteert alleen signaal in de cellen van de H596 en de sonde van de E14/E15 detecteert alleen signaal in de A549 cellen (cijfers 6B en 6 C). Tot slot, de sonde voor dapB toonde geen signaal, dat aangeeft geen achtergrond-signaal (cijfers 6B en 6 C). Over het geheel genomen, deze gegevens toont specifieke detectie van de BMO variant METΔ14 in situ met behulp van de automatische bepaling van de BaseScope. Figuur 1 : De werkstroom assay. De werkstroom bestaat uit 4 belangrijke stappen: voorbehandeling aan permeabilize van cellen of weefsel, de kruising van de sonde naar doel RNA, signaal versterking, en signaal detectie door visualisatie onder helderveld of fluorescentie Microscoop. Afzonderlijke puntjes kunnen worden gekwantificeerd aan de hand van een digitaal beeld analyse platform. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 : Illustratie van het protocol van de handmatige assay. De gehele bepaling kan worden afgerond in 9 h. voorbehandeling keer afhankelijk van weefseltype, variëren kunnen dus het is aangeraden om bijlage A in de gebruikershandleiding raadplegen voor weefsel voorbehandeling aanbevelingen met betrekking tot de incubatietijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Representatief beelden van exon junction detectie. (A) getoond hier zijn de exon-organisatie voor EGFR WT en EGFRvIII afschriften en een schematische voorstelling afgebeeld dubbel-Z exon junction sondes die straddle de kruising te sporen EGFR WT of EGFRvIII. (B) de exon junction assay werd uitgevoerd op twee FFPE glioblastoma monsters met behulp van de sondes vermeld in (A), evenals een positieve controle sonde, POLR2A en negatieve controle sonde, dapB. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Representatief beelden van korte doel volgnummer detectie. (A) getoond hier zijn CDR3 sequenties in Jurkat cellen. De volgorde in het zwart is een begeleidende gemeenschappelijke reeks en de volgorde in het rood is uniek voor de CDR3α of CDR3β. Dubbel-Z korte doel reeks sondes werden ontworpen tegen deze sequenties. (B) de korte target test werd uitgevoerd op Jurkat cellen bedoeld als een FFPE cel pellet met behulp van anti-zin of gevoel sondes gericht op de sequenties in (A), en dapB werd gebruikt als een negatieve controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5 : Representatief beelden van punt mutatie detectie. (A) de test werd uitgevoerd op H2229 cellen (homozygoot voor EGFR L858) en H1975 cellen (heterozygoot voor de mutatie EGFR L858R) bedoeld als een FFPE cel pellet met behulp van één dubbel-Z punt mutatie sondes gericht op de EGFR L858 WT sequentie of EGFR L858R gemuteerde volgorde. (B) de punt mutatie test werd uitgevoerd op HuT78 cellen (homozygoot voor KRAS G12A) en SW116 cellen (heterozygoot voor de mutatie KRAS G12A) bedoeld als een FFPE cel pellet met behulp van één dubbel-Z punt mutatie sondes gericht op de KRAS G12 WT volgorde of KRAS G12A gemuteerd volgorde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6 : Representatief beelden van geautomatiseerde kleuring met de exon junction assay. (A) getoond hier is de organisatie van de exon voor ONTMOETTE WT en METΔ14 afschriften en een schematische voorstelling afgebeeld enkele dubbel-Z exon junction sondes die straddle de kruising te sporen WT ONTMOETTE of METΔ14. (B) en (C) de geautomatiseerde exon junction test werd uitgevoerd op H596 cellen (uitdrukken METΔ14) en A549 cellen (uiten ONTMOETTE WT) bedoeld als een FFPE cel pellet met behulp van de sondes vermeld in (A), evenals de negatieve controle sonde dapB. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Exon Junction Korte opeenvolging Punt mutatie Splice variant/isovorm Sequenties tussen de 50 en 300 nt Punt mutatie Circulaire RNA (circRNA) Zeer homologe reeksen Korte indel Gene fusion De volgorde van de CDR3 voor de TCR klonen Gene bewerken Gene knock-out (KO) Pre-miRNA Klein nucleolar RNA (snoRNA) Gene bewerken Tabel 1: toepassingen van de in situ assay. Er zijn 3 grote categorieën voor toepassingen van deze test: exon junction, korte doel opeenvolging, en punt mutatie. In elke kolom zijn enkele voorbeelden van de specifieke toepassing voor elke categorie.

Discussion

In dit verslag waren de roman ISH assay protocol en haar toepassingen in detail besproken. De bepaling voorziet in de directe visualisatie van de exon kruispunten, korte-target en zeer homologe reeksen en puntmutaties in het kader van het weefsel. De bepaling is gebaseerd op RNAscope technologie5 en is daarom geschikt voor enkel molecuul detectie. Echter, als gevolg van een systeem van de geavanceerde versterking, het signaal kan worden gedetecteerd met sondes met zo weinig als een paar van de dubbel-Z of met een doel sjabloon lengte van slechts 50 nucleotiden. Omdat de sondes kunnen zo kort zijn als een enkele dubbel-Z in lengte, zorgt dit voor de detectie van puntmutaties (tabel 1), exon kruispunten en korte-target en zeer homologe reeksen.

Voor de succesvolle prestaties van de test zijn er enkele technische aanbevelingen. Weefsels, moeten eerst op kamertemperatuur voor 16-32 h10in vers 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) te worden vastgesteld. Underfixation ( 32 h) prestaties van de bepaling zal aantasten en wellicht aanvullende optimalisatie. Ten tweede, om te zorgen voor een optimale controle van temperatuur en vochtigheid, die nodig voor robuuste sonde hybridisatie en signaal versterking zijn, de dia verwerking systeem en kruising oven moet worden gebruikt voor protocol stappen 2.3 tot en met 5 (protease voorbehandeling, sonde hybridisatie, signaal versterking en signaal detectie). Derde, overtollige residuele buffers moet goed gedecanteerde vóór elke stap in het gehele protocol (maar niet zozeer zelfs dat de weefselsecties uitdrogen). Als de dia’s uitdrogen, zal aanzienlijke aspecifieke signaal ontwikkelen. Ten vierde, afhankelijk van het weefseltype, voorbehandeling optimalisatie kan nodig zijn. Met behulp van de mis-protease of uitvoeren voor een suboptimaal tijdsduur kan resulteren in onder – of over – digestion en het signaal negatief zal beïnvloeden. Tot slot is het belangrijk dat positieve en negatieve controles worden altijd uitgevoerd met de test-sondes. Negatieve controle sondes ervoor zorgen dat er geen achtergrond-signaal is, en positieve controle sondes ervoor te zorgen dat de test correct heeft gedaan en dat de kwaliteit van de RNA in de steekproef optimaal is voor de interpretatie van de testresultaten van de sonde. Als er geen signaal met de positieve controle-sonde, is dan is de kwaliteit van de RNA in het monster waarschijnlijk suboptimaal en een kan signaal niet gezien worden met het testpunt.

Naast de handmatige assay werd de mogelijkheid voor het uitvoeren van de bepaling op geautomatiseerde stainers ook aangetoond (Figuur 6). Deze geautomatiseerde ISH assay levert een hoge signaal-/ ruisverhouding en geldt voor dezelfde toepassingen als aangegeven in tabel 1; echter zijn de voordelen van een geautomatiseerde test zijn standaardisatie van assay voorwaarden, minimalisering van variabiliteit tussen gebruiker en hands-on tijd, en uitkering voor high-throughput screening van weefselmonsters op betrouwbare wijze.

Terwijl immunohistochemistry (IHC) en qRT-PCR voor detectie van splice varianten (met name EGFRvIII), in klinische monsters van FFPE, deze technieken kunnen gebrek aan de nodige specificiteit en bieden geen inzicht in de ruimtelijke resolutie van de splice Variant-expressie, respectievelijk11,12. Een belangrijk voordeel van de bepaling in dit protocol is haar zeer gevoelige en specifieke visualisatie van splice kruispunten met behoud van de morfologische weefsel context. Hier, was de bepaling van vermogen precies richten op unieke exon kruispunten voor verschillende varianten van de splice, met inbegrip van EGFRvIII en METΔ14, aangetoond (cijfers 3 en 6). Daarnaast is de bepaling gebleken om te ontdekken de splice variant AR-V7 in prostaatkanker, meerdere isoforms van ErbB4 in de hersenen, en bevestiging van knockout van circulaire RNA-Cdr1as in de muis hersenen3,13,14.

Korte Doelsector Detectie van de sequentie door deze ISH assay zorgt voor visualisatie van RNA opeenvolgingen zo kort als 50 nucleotiden lang, zoals blijkt uit de detectie van CDR3 sequenties afgeleid van Jurkat cellen (Figuur 3). De test kan ook detecteren gensequenties die zeer homoloog aan andere familieleden of soorten, zoals getoond door Revêchon et al.., die gebruikt de korte doel assay voor het opsporen van menselijke progerin uitgedrukt in muis subcutane witte vetweefsel15. Bovendien kunnen klein nucleolar RNA (snoRNA), CRISPR-gemedieerde gene bewerken en voorloper-microRNA worden gevonden in situ met de korte target test. Meer recentelijk, Fu et al. gecombineerd deze ISH-assay met IHC precieze cellen in het netvlies uitdrukken van de pre-miRNA mir125b16worden geïdentificeerd.

Mutatie profilering in tumoren is essentieel voor de studie van de progressie van de tumoren en voor de ontwikkeling van gerichte therapieën. Terwijl mutatie profiling kan worden bereikt via hoge-doorvoer sequencing, deze technologie kan niet volledig aan de orde intratumoral heterogeniteit of link genetische wijzigingen met cellulaire morfologie17,18. De detectie van puntmutaties die met behulp van deze test ISH zorgt voor onderscheid van RNA opeenvolgingen van het doel met een single-base resolutie, als gevalideerd door de detectie van EGFR L858R KRAS G12A single nucleotide variaties in en cellijnen (Figuur 5). Bovendien gebruikt Baker et al. de bepaling van punt mutatie te richten op meerdere mutaties in de BRAF, KRAS en PIK3CA oncogenen in colorectal kanker18. Ze waren in staat om te identificeren en ruimtelijk kaart zeldzame mutant subklonen van tumorcellen, uiteindelijk tonen hoe zij bijdragen tot de heterogeniteit van de intra-tumor.

Kortom, is een gespecialiseerde RNA ISH assay ontwikkeld. Deze methode zorgt voor de detectie van splice varianten, korte reeksen en mutaties in situ. Het is gevoelige, specifieke, meetbare en aanpasbaar aan prestaties door handmatige methoden zowel op geautomatiseerde stainers.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Materials

HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) ACD 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II)
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) ACD 310012
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 ACD 310017
HybEZ Humidifying Paper ACD 310015
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)  Vector Laboratory  H-4000
SuperFrost Plus Slides (required)  Fisher Scientific  12-550-15
10% neutral-buffered formalin (NBF)  MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paraffin wax MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microtome MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Gill’s Hematoxylin I  American Master Tech Scientific/MLS  HXGHE1LT MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Xylene  Fisher Scientific/MLS X3P-1GAL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack  American Master Tech Scientific/MLS LWSRA24 MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Staining Dishes  American Master Tech Scientific/MLS LWT4457EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant  American Master Tech Scientific/MLS LWT4456EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
100% alcohol (EtOH)  American Master Tech Scientific/MLS ALREACS MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) Vector Labs  H-5000
Cover Glass, 24 x 50 mm Fisher Scientific/MLS  12-545-F MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Ammonium hydroxide, 28–30% Sigma-Aldrich/MLS 320145-500mL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Carboy (>3L) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer / /
Digital thermometer MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Pipettors and tips, 1–1000 μL MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Distilled water MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tubes (various sizes) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Fume hood MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Graduated cylinder MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Parafilm MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paper towel or absorbent paper MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microcentrifuge MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microscope and accessories MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Formaldehyde MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Histogel Fisher Scientific/MLS 22-110-678
BaseScope Reagent Kit – RED Advanced Cell Diagnostics 322900
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 Advanced Cell Diagnostics 701701
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 Advanced Cell Diagnostics 701711
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 Advanced Cell Diagnostics 701721
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 Advanced Cell Diagnostics 701731
BaseScope Hs-MET-E14E15 Advanced Cell Diagnostics 701811
BaseScope Hs-MET-E13E15 Advanced Cell Diagnostics 701801
BaseScope Hs-KRAS-G12A Advanced Cell Diagnostics 705491
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT Advanced Cell Diagnostics 705531
BaseScope Hs-EGFR-L858R Advanced Cell Diagnostics 705451
BaseScope Hs-EGFR-L858WT Advanced Cell Diagnostics 705461
BaseScope Control Probe Pack Human Advanced Cell Diagnostics 322975
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
  2. Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).
  3. Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
  4. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
  5. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  6. Paraffin processing of tissue. Protocols Online Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016)
  7. An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. , (2018).
  8. Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).
  9. Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).
  10. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).
  11. Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).
  12. Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).
  13. Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. , (2017).
  14. Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. , (2017).
  15. Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).
  16. Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).
  17. Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).
  18. Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).

Tags

Genetic VariantsShort TargetsPoint MutationsRNA In Situ HybridizationCell Type ExpressionSplice VariantsNeurociênciaOncologyExon JunctionsSensitivitySpecificitySingle CellsFormalin FixationParaffin EmbeddingMicrotome SectioningTarget RetrievalWash BufferHematoxylin CounterstainProbe HybridizationAmplification Reagents

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Anderson, C. M., Laeremans, A., Wang, X. M., Wu, X., Zhang, B., Doolittle, E., Kim, J., Li, N., Pimentel, H. X. Y., Park, E., Ma, X. Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay. J. Vis. Exp. (138), e58097, doi:10.3791/58097 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image