JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Визуализация генетических вариантов, короткие цели и точечные мутации в контексте морфологических ткани с РНК в Situ гибридизация Assay

Published: August 14, 2018
doi:
10.3791/58097
, , , , , , , , , ,
1Advanced Cell Diagnostics, Inc

Summary

Здесь мы описываем в situ гибридизация assay который позволяет чувствительной и конкретных обнаружения последовательностей как короче 50 нуклеотидов с единого нуклеотидом резолюции на уровне одной ячейки. Анализа, который может выполняться автоматически или вручную, можно включить визуализация сращивания варианты, коротких последовательностей и мутации в контексте ткани.

Abstract

Поскольку точность медицина сильно зависит от точного обнаружения биомаркеров, существует растущая потребность стандартизированных и надежные технологии, которые измеряют РНК биомаркеров в situ в клинических образцах. В то время как grind и bind анализов, как RNAseq и количественного RT-PCR включение высокочувствительный ген выражение измерения, они также требуют РНК добыча и тем самым предотвратить ценные выражение анализа в контексте морфологических ткани. В situ гибридизация (ISH) пробирного описанных здесь можно обнаружить РНК последовательности как короче 50 нуклеотидов в резолюции единого нуклеотидом и на уровне одной ячейки. Этот assay дополняет ранее разработанной коммерческих пробирного и позволяет чувствительной и конкретных на месте обнаружения сращивания варианты, короткие цели и точечные мутации в ткани. В этом протоколе зонды были разработаны для целевых уникальных экзона развязок для двух вариантов клинически важные соединения, EGFRvIII и METΔ14. Обнаружение короткие последовательности была продемонстрирована конкретного обнаружения последовательностей CDR3 Т-клеточных рецепторов α и β в строке Jurkat Т-клеток. Также показана полезность этот assay ISH для различения РНК последовательности в резолюции (точечные мутации) единого нуклеотидом через визуализацию EGFR L858R и КАРСТЕ G12A единого нуклеотидом вариации в клеточных линий, с помощью автоматизированных пятнать платформы. Таким образом протокол показывает специализированных РНК ISH assay, который позволяет обнаружение сращивания вариантов, коротких последовательностей, и мутации в situ для ручной работы и на автоматизированных stainers.

Introduction

Высок объём транскриптомики технологии, такие как microarrays и следующего поколения РНК последовательности (RNAseq) экспоненциально повысили открытия биомаркеров РНК с диагностические, прогностические и прогнозирования клиническое значение для различных заболеваний, в том числе Рак1,2. Чтобы продвинуть использование этих биомаркеров в точности медицины, есть высокая потребность в стандартизированной и надежные технологии, которые можно измерить РНК биомаркеров в контексте клинических образцов ткани. Хотя широко grind и bind анализы как RNAseq и количественного RT-PCR включение высокочувствительный ген выражение измерения, требуемые ткани гомогенизации и РНК изоляции подразумевают потери в естественных условиях специфики камерного типа и Морфологическая информация3. Обычные в situ РНК методологиях обнаружения отсутствие чувствительности и специфичности, необходимые для надежного измерения редких или низкий выражая биомаркеров РНК в контексте ткани4.

Коммерческая в situ гибридизация (ISH) пробирного (например., проба RNAscope) является одной из технологий, которая имеет решить эти проблемы, а также позволяет весьма деликатного и конкретных визуализации одной молекулы РНК, больше чем 300 нуклеотидов в контексте морфологических ткани. Этот тип анализа использует уникальный олигонуклеотида зонд дизайн примерно 6 – 20 двойной Z зонд пар в сочетании с усиления передовые на основе гибридизации сигнала5.

Это исследование описывает специализированных пробирного РНК ISH, BaseScope, в дополнение к ранее конструированного коммерческие технологии, которая может обнаружить РНК последовательности как короче 50 нуклеотидов в единичных нуклеотидных резолюции. Этот assay рассматриваются сложные сложности транскриптом и применима для точного обнаружения экзона развязок, короткие последовательности и точечные мутации в контексте ткани (Таблица 1), с помощью одной двойной Z зонд пары. Этот доклад свидетельствует протокол assay полный и его использование в обнаружении сращивания вариантов, CDR3 последовательности для Т-клеточный рецептор клонов, и единого нуклеотидом мутации в FFPE клеточной линии и опухолевых тканей.

Protocol

Человека опухоли образцы, используемые в данном исследовании были deidentified и приобрела из коммерческих источников в соответствии с местными этические руководящие принципы для исследований человеческого. 1. образец, оборудование и подготовка реагента Подготовка образца FFPE Ткани Сразу после вскрытия, исправить ткани (нарезать блоки 3-4 мм в толщину) в 10% буферизацией нейтрального формалина (NBF) для 16-32 ч при комнатной температуре (RT).Примечание: Время фиксации будет варьироваться в зависимости от типа ткани и размер. Вымойте образца с 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) и обезвоживанию, с помощью ряда стандартных этанола (EtOH) (70% EtOH за 30-60 мин, 80% EtOH за 30-60 мин, 90% EtOH для 30 – 60 минут, 95% EtOH за 30-60 мин, 3 x 100% для EtOH 30-60 мин) следуют ксилол. Внедрить образца в парафин, используя стандартные процедуры6 и обрезать парафиновых блоков при необходимости для удаления избыточных парафина.Примечание: Размер блока будет варьироваться в зависимости от размера выборки ткани, но типичный размер – 0.75 x 0,75 дюйма2 или меньше. Линии клетки Собирать и Пелле клетки согласно Рекомендуемые методы для конкретной ячейки строки. Исправьте клетки в 10% формальдегида на RT для 24 h на ротатора. Подготовка клетки как гранулы в подогретую обработки гель (например., Histogel). Разрешить Пелле затвердеть, поместив гель клеточной гранул на кусок парафина на льду и пусть сидят на 2 – 3 мин Submerge гель клеточной Пелле в однократном ПБС. Обезвоживанию и вставлять ячейки гранулы, как описано в шаге 1.1.1. В разделе Подготовка Нарезать 5 ± 1 мкм разделы, используя микротом встроенных ткани/клетки, смонтировать разделы на слайдах электростатически клей стекла и просушите их на ночь на RT.Примечание: Слайды могут храниться на RT под высыхания до 3-х месяцев. Место слайды в стойку слайд и выпекать навесные ткани слайды в циркулирующего воздуха печи при 60 ° C для 1 h перед выполнением assay.Примечание: Используйте слайды сразу или хранить их в RT с сиккативов на срок до 1 недели. Длительного хранения может привести к деградации РНК. Подготовка оборудования Установить печь гибридизации до 40 ° C. Тщательно мокрой увлажнения бумаги и удалите любые остаточные dH2O. Вставьте бумагу в лоток контроля влажности и Вставьте лоток в печь гибридизации prewarm по крайней мере 30 минут перед использованием. Подготовка реагента Заполнить два очистки агента блюда с 200 мл ксилол и заполнить два окрашивание блюда с 200 мл 100% EtOH, который будет использоваться для депарафинизации секций. Подготовка 200 mL реагента коммерчески доступных 1 x целевой поиск путем добавления 180 мл dH2O 20 мл 10 x цели получения реагента. Место два слайд Держатели в пароварку. Заполнить один слайд держатель с 200 мл 1 x цели получения реагента и заполнить другой слайд держатель с 200 мл dH2O. тепла оба решения до кипения, используя пароварку. Подогретую буфера мытья теплой 50 x до 40 ° C на 10 – 20 мин подготовить 3 L 1 x мыть буфера путем разбавления 60 мл 50 x мыть буфер с 2,94 Л dH2O. В Зонта Подготовьте 50% Гилл гематоксилином counterstaining решение, добавив гематоксилином Гилл в 100 мл до 100 мл dH2O. В Зонта Подготовьте воронение реагента (0,02% (w/v) аммиачная вода), добавив 1,43 мл гидроксида аммония 28 – 30% в 250 мл dH2O. Prewarm целевой зондов при 40 ° C за 10 мин до зонд гибридизации и принести RT. усилительных реагентов (AMP 0-6) 2. РНК в Situ гибридизация Assay Депарафинизации и обезвоживания После выпечки, как описано в шаге 1.1.3.2 (необязательный остановочный пункт 1), deparaffinize разделы в ксилоле на 5 мин с агитации. Deparaffinize снова в свежих ксилол для 5 минут Dehydrate в 100% EtOH на 2 мин с агитация и повторять снова в свежих 100% EtOH на 2 мин. Воздух сухой слайды для 5 мин при 60 ° C в циркулирующего воздуха печи или на RT до тех пор, пока они полностью сухой (необязательный остановочный пункт 2). Образец взрывоопасностью Инкубируйте секции с ~ 4 капель перекиси водорода готовых к использованию для 10 мин на RT для утоления активности эндогенной пероксидазы. Декантируют раствор из слайдов и промойте их дважды dH2O. Инкубируйте секции с 200 мл реагента целевого поиска для 15 – 30 мин при температуре 100 ° C в пароварку.Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от типа ткани. В этом протоколе целевого поиска была исполнена для 15 мин как образцы опухоли, так и клеток гранулы. Декантируют раствор из слайдов, дважды промыть dH2O, окунуть в 100% EtOH 3 мин, и сухой, слайды в 60 ° C в циркулирующего воздуха печи или в РТ, до тех пор, пока полностью сухой. Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг секции с использованием гидрофобных пера, приблизительно 0,75 х 0,75 дюйма2.Примечание: Не рекомендуется сделать меньше барьер. Для более крупных разделов больше барьер нужно будет извлечь. Пусть барьер сухой полностью за 1 мин, или оставить на ночь на RT (необязательный остановочный пункт 3). Место слайды в слайд владельца и поместите слайд владельца в лоток контроля влажности. Добавить ~ 4 капли протеазы III для каждого слайда и Инкубируйте 15 – 30 мин при 40 ° C в гибридизации печи для переваривания белка.Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от типа ткани. В этом протоколе протеазы пищеварение была исполнена для 30 минут для образцов опухоли и 15 минут для ячейки окатышей. Декантируют раствор из слайдов и промойте их дважды dH2O. Зонд гибридизации Добавьте ~ 4 капли раствора соответствующие готовых к использованию зонд для покрытия всего раздела. При использовании более крупные разделы, добавить ~ 5-6 капель. Гибридизируйте зонды для 2 ч при 40 ° C в печь гибридизации. Декантируют раствор из слайдов и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стиральная в этом шаге. Усиления сигнала Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 0 на слайде при 40 ° C в гибридизации духовку на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфера для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стиральная в этом шаге. Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 1 каждого слайда при 40 ° C в гибридизации духовку на 15 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки. Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 2 каждого слайда при 40 ° C в гибридизации духовку на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки. Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 3 на слайде при 40 ° C в гибридизации духовку на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки. Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 4 на слайде при 40 ° C в гибридизации духовку на 15 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки. Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 5 на слайд в РТ на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки. Инкубировать разделы с ~ 4 капель AMP 6 каждого слайда на RT на 15 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки. Обнаружение сигнала Подготовьте быстро красный краситель рабочего раствора. Для одного слайда с 0,75 х 0,75 дюйма2 барьер, добавить 2 мкл краска быстро красно-B 120 мкл быстро красно-A в трубку и хорошо перемешать.Примечание: В зависимости от размера гидрофобный барьер и количество слайдов, будет отличаться томов быстро красный рабочего раствора. Декант избыток жидкости от слайды и добавить быстро красный краситель рабочего раствора к слайдам. Инкубируйте слайды для 10 мин на RT в лоток с крышкой, чтобы избежать воздействия света.Примечание: Используйте быстрый красный рабочего раствора в течение 5 мин, подготовки и не подвергать его прямого солнечного света или ультрафиолетового света. Сцеживаться быстро Красного раствора и промыть слайды дважды с водопроводной водой. Место слайды обратно в слайд стойку. Counterstaining Counterstain разделов ткани с 50% Гилл гематоксилином решение для 2 мин на RT. мыть слайды с водопроводной водой и повторите это несколько раз, пока не ясно, в то время как разделы остаются фиолетовый слайды. Окуните слайды в 0,02% аммиачной воды для воронение (dip 2 – 3 раза). Замените воду аммиака с водопроводной водой и вымыть слайды 3 – 5 раз. Монтаж на салазках Сухой слайды в циркулирующего воздуха печи на 60 ° C в течение 15 мин или RT до тех пор, пока полностью сухой. Место 1 – 2 капли реагента монтажа на каждый слайд и место coverslips над каждой секции. Избегайте любой перехват воздушных пузырьков. Воздух сухой слайды для по крайней мере 5 минут.Примечание: Быстро красный субстрат алкоголя чувствительных. Не обезвоживая слайды в спирте. Визуализация Наблюдать за слайды под микроскопом стандартного brightfield.

Representative Results

В situ гибридизация пробирного рабочий процесс:Рабочий процесс изображен на рисунке 1 и состоит из четырех частей: permeabilization клеток или тканей с целевого поиска и протеазы решения, Гибридизация зондов к целевому РНК, сигнал амплификация и визуализация сигнала. Сигнал также могут быть количественно с помощью цифровых изображений программного обеспечения систем или полуколичественного образом основанный на количество точек на ячейку. Ручной процедуры, описанной в рисунке 2 также полностью автоматизированной в коммерческих системах, auto окрашивание. Представитель пятнать экзона Джанкшен обнаружения (EGFRvIII соединитель вариант): EGFRvIII представляет собой вариант рецептор эпидермального фактора роста, который возникает от рамы геномной удаления экзонов 2-7, ведущей к конститутивно активных онкогенные сигнальные7 . Проба была использована для выявления EGFRvIII статус в образцах опухоли глиобластома (GBM) FFPE. Одноместный Двухместный Z зонды были разработаны для диапазона экзона развязок с целью обнаружения либо WT, мутант, или обоих протоколов (рис. 3A). Зонды WT EGFR охватывают развязок экзонов 1 и 2 (E1/E2) или экзонов 7 и 8 (E7/E8), в то время как EGFRvIII конкретных зонды охватывают стыке экзонов 1 и 8 (E1/Е8). Общие зонд, который охватывает стыке экзонов 8 и 9 (E8/E9) также используется для обнаружения всего EGFR (WT и EGFRvIII стенограммы). Все датчики были затем используется для определения EGFR статус в FFPE GBM образцов. Два представителя примера, показано на рисунке 3B были взяты из более широкого исследования. EGFR статус был подтвержден самостоятельного метода, RT-PCR. Обе WT зонды обнаружен сигнал в обоих образцах, указав, что двух образцов Экспресс WT EGFR (рисунок 3B). Однако мутант зонд показали только обнаружения сигнала в EGFRvIII + образца, подтверждающий, что этот пример действительно позитивным для EGFRvIII вариант (рисунок 3B, левой панели). И наоборот мутант зонд не обнаруживает сигнал в образце EGFRvIII (рисунок 3B, правой панели). Взятые вместе, эти результаты показывают, что экзона Джанкшен assay может определить статус EGFRvIII в образцах опухоли GBM FFPE. Представитель пятная для нескольких целей:CDR3 или дополнительных определяющих регион 3, является весьма переменной домен в Т-клеточных рецепторов. Как правило последовательность CDR3 довольно короткий; к примеру, CDR3 α и β последовательности от линии Jurkat Т-клеток, 51 и 48 нуклеотидов в длину, соответственно (рис. 4A). Для выявления специфических последовательностей CDR, выраженная в Jurkat клетки, антисмысловых зонды для CDR3 α и β, которые выражаются в строке Jurkat Т-клеток были созданы, в дополнение к чувство зонды для CDR3 α и β в качестве отрицательного контроля датчиков. Все датчики были затем испытания в подготовленный FFPE Jurkat клеток с assay. Надежные окрашивание было отмечено с анти смысле зонды для обоих CDR3 α и β в Jurkat клетках, тогда как смысл зонды обнаружено мало не сигнал (рис. 4B). Эти результаты демонстрируют короткие целевого анализа способность различать между весьма переменной, но короткие последовательности CDR для клоны Т-клеточного рецептора. Представитель пятная для Точечная мутация EGFR L858R:Точечная мутация зонды были разработаны для выявления единичных нуклеотидных вариации и небольшие вставки или удаления (INDELs) в контексте опухоли. Рисунок 5A демонстрирует способность в месте обнаружения Точечная мутация EGFR L858R (2573T > G). Были разработаны два датчика: один для обнаружения L858R мутировал EGFR последовательности, а другой для определения последовательности EGFR L858 WT. Обе зонды были протестированы в двух подготовленных FFPE клеточных линий: H2229, который только выражает EGFR L858 WT; и H1975, который является гетерозиготных EGFR L858R мутации. L858R мутант зонд обнаружил сигнал только в линии клеток H1975, но не в строке ячейки H2229. Однако WT зонд обнаружил сигнала в обеих линий клетки. Аналогично, Рисунок 5B визуализирует в месте обнаружения Точечная мутация крас G12A (35 G > C). Два зонда были предназначены для обнаружения крас G12A MT и КАРСТЕ G12 WT последовательности, а затем испытания на линии клеток HuT78, (который только выражает крас G12 WT) и линии клетки SW116 (которая является гетерозиготных крас G12A мутации). В то время как зонд крас G12 WT обнаружен сигнал в обоих клеточных линий, крас G12A зонд только обнаружен сигнал в линии клетки SW116. Взятые вместе, эти данные продемонстрировать технические возможности анализа Точечная мутация в обнаружение единичных нуклеотидных полиморфизмов в контексте клеток и тканей. Представитель окрашивания для assay автоматизированной на месте :Автоматические тесты позволяют большее количество образцов выполняться более надежно, минимизации изменчивости между пользователем и практический время и генерации последовательно воспроизводимость результатов. Таким образом была разработана автоматизированная версия assay. Чтобы продемонстрировать автоматического окрашивания с этот assay, было рассмотрено обнаружения соединитель вариант METΔ14. Этот вариант является результатом 14 экзона гена MET, пропускаются при пре мРНК сплайсинга, что приводит к активации учредительного и онкогенных трансформации ВСТРЕТИЛ рецептор8,9. Конкретно определить вариант METΔ14, были разработаны два экзона Джанкшен зондов: один, который охватывает стыке экзонов 13 и 15 (E13/E15) для обнаружения METΔ14 вариант Стенограмма и другой, который охватывает стыке экзонов 14 и 15 (E14/E15) для обнаружения ВСТРЕТИЛ WT Конспект (рис. 6A). Обоих зондов затем были протестированы в 2 FFPE-подготовлен клеточных линий: H596, которая выражает METΔ14 вариант, и A549, который выражает ген WT встретились. Обоих зондов показала шаблоны взаимоисключающих выражений, с зонд E13/E15, только обнаружения сигнала в H596 клетки и зонд E14/E15, только обнаружение сигнала в A549 клетках (цифры 6B и 6 C). И наконец зонда для dapB показал не сигнал, указывающий нет фонового сигнала (цифры 6B и 6 C). В целом эти данные демонстрирует конкретные обнаружение ВСТРЕТИЛ вариант METΔ14 в месте использования автоматизированных BaseScope assay. Рисунок 1 : Рабочий процесс пробирного. Рабочий процесс состоит из 4 основных этапов: предварительной обработки для разрушения клеток или тканей, гибридизация зонда к целевому РНК, сигнал амплификация и сигнал обнаружения по визуализации под brightfield или люминесцентных микроскопов. Отдельные точки могут быть количественно с помощью платформы анализа цифровых изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 : Иллюстрация протокол ручной assay. Весь assay может быть завершена в 9 ч. время может варьироваться в зависимости от типа ткани, поэтому рекомендуется консультироваться с добавление A в руководстве пользователя для ткани предварительной рекомендации относительно время инкубации предварительной обработки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 : Представитель изображений экзона Джанкшен обнаружения. (A) показанный здесь являются экзона Организации EGFR WT и EGFRvIII стенограммы и схема с изображением двойной Z экзона Джанкшен зонды, попадающие на двустраничный перекрестка для обнаружения EGFR WT или EGFRvIII. (B) экзона Джанкшен пробирного была выполнена на двух образцах глиобластома FFPE с помощью зондов, перечисленных в (A), а также положительный контроль зонда, POLR2A и отрицательный контроль зонда, dapB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4 : Представитель изображения короткие цели последовательности обнаружения. (A) показанный здесь являются CDR3 последовательности в Jurkat клетках. Последовательность в черном фланкируя общую последовательность и последовательность в красном является уникальной для CDR3α или CDR3β. Одноместный Двухместный Z короткие целевой последовательности зонды были разработаны против этих последовательностей. (B) короткие целевого анализа была выполнена на Jurkat клетки, подготовленных как Пелле FFPE клеток, с использованием анти чувство или ощущение датчики ориентации последовательности в (A), и dapB был использован в качестве отрицательного контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5 : Представитель образы обнаружения Точечная мутация. (A) проба была выполнена на H2229 клетки (гомозиготных для EGFR L858) и H1975 клетки (гетерозиготных EGFR L858R мутации) подготовлен как Пелле клеток FFPE, с помощью одной двойной Z Точечная мутация датчики ориентации EGFR L858 WT последовательности или EGFR L858R Мутировавшие последовательность. (B) пробирного Точечная мутация была выполнена на HuT78 клетки (гомозиготных для крас G12A) и SW116 клетки (гетерозиготных крас G12A мутации) подготовлен как Пелле клеток FFPE, с помощью одной двойной Z Точечная мутация датчики ориентации крас G12 WT последовательности или Крас G12A мутировал последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6 : Представитель изображения автоматического окрашивания с перекрестка assay экзона. (A) показанный здесь является экзона организации встретились WT и METΔ14 стенограммы и схема с изображением одной двойной Z экзона Джанкшен зонды, попадающие на двустраничный перекрестка для обнаружения ВСТРЕТИЛ WT или METΔ14. (B) и (C) автоматизированных экзона Джанкшен пробирного была исполнена на H596 клетки (выражая METΔ14) и A549 клетки (выражая ВСТРЕТИЛ WT) подготовлен как Пелле FFPE клеток, с использованием зондов, перечисленных в (A), а также отрицательный контроль зонда dapB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Эксон Джанкшн Короткую последовательность Точечная мутация Вариант/изоформы для сращивания Последовательности между 50 и 300 nt Точечная мутация Циркуляр РНК (circRNA) Весьма гомологичных последовательности Короткие indel Джин фьюжн CDR3 последовательность TCR клонов Джин редактирования Нокаут гена (KO) Pre-miRNA Малые ядрышковые РНК (snoRNA) Джин редактирования Таблица 1: применение на месте assay. Существует 3 основных категории для приложений этот assay: экзона Джанкшен, короткие последовательности и Точечная мутация. В каждом столбце перечислены некоторые конкретные примеры для каждой категории.

Discussion

В настоящем докладе подробно обсуждались Роман протокол assay иш и ее применения. Assay позволяет для прямого визуализации экзона развязок, короткие цель и высоко гомологичных последовательности и точечные мутации в контексте ткани. Проба основана на технологии RNAscope5 и поэтому способен одной молекулы обнаружения. Однако из-за передовых Усилительная система, сигнал могут быть обнаружены с зондами, содержащие как одна пара двойных Z или целевой шаблон длиной всего 50 нуклеотидов. Потому что зонды могут быть как короткий как один двойной Z в длину, это позволяет для обнаружения экзона развязок, короткие цель и высоко гомологичных последовательности и точечные мутации (Таблица 1).

Для успешного выполнения анализа существует несколько технических рекомендаций. Во-первых тканей должна быть исправлена в свежие 10% буферизацией нейтрального формалина (NBF) при комнатной температуре для 16 – 32 h10. Underfixation ( 32 h) будет ухудшить производительность пробирного и может потребовать дополнительной оптимизации. Во-вторых для обеспечения оптимального контроля температуры и влажности, которые требуются для надежной зонд гибридизации и сигнала Усилители, слайд обработки системы и гибридизации печи должны использоваться для протокола шаги 2.3-5 (протеазы предварительной обработки, зонд Гибридизация, усиления сигнала и сигнала). Третьих, превышение остаточных буферы должны быть должным образом отстой перед каждым шагом на протяжении протокол (но не настолько, что в разделах ткани высохнуть). Если слайды высохнуть, значительные неспецифичный сигнал будет развиваться. В-четвертых в зависимости от типа ткани, может потребоваться предварительная оптимизация. Использование неправильно протеазы или выполнении субоптимальные количество времени может привести к в под – или над – digestion и отрицательно будет влиять на сигнал. И наконец важно всегда запускать положительной и отрицательной контроля с зондами теста. Отрицательный контроль зонды убедитесь, что нет фонового сигнала, и зонды позитивного управления убедитесь, что assay было сделано правильно, и что качество РНК в образце является оптимальным для интерпретации результатов тестов зонд. Если нет сигнала с положительный контроль зонда, то качество РНК в образце, скорее всего неоптимальной и сигнал не может быть видно с пробник.

В дополнение к ручной assay способность выполнить пробу на автоматизированных stainers был также продемонстрировал (рис. 6). Этот автоматизированный assay иш дает высокое соотношение сигнал шум и применима для тех же приложениях, как показано в таблице 1; Однако преимущества автоматизированных assay включают стандартизации анализа условий, минимизации изменчивости между пользователем и практический времени и пособие для высокопроизводительного скрининга образцов ткани надежным способом.

Хотя иммуногистохимия (IHC) и qRT ПЦР позволяет для обнаружения сращивания вариантов (особенно EGFRvIII), в FFPE клинических образцов, эти методы необходимые неконкретны и не предлагаем проницательность в пространственное разрешение сращивания выражение типа Variant, соответственно11,12. Ключевым преимуществом assay в этот протокол является его весьма деликатного и конкретных визуализации сращивания стыков при сохранении контексте морфологических ткани. Здесь способность пробирного точного уникальный экзона развязок для нескольких вариантов соединения, включая EGFRvIII и METΔ14, была продемонстрирована (рисунки 3 и 6). Кроме того было показано assay обнаружить соединитель вариант AR-V7 рака простаты, нескольких изоформ ErbB4 в мозге и подтверждение нокаут круговой Cdr1as РНК в мыши мозга3,,1314.

Короткие последовательности обнаружения, этот assay иш позволяет для визуализации РНК последовательности как 50 нуклеотидов в длину, короче, как свидетельствует обнаружение CDR3 последовательностей, производный от Jurkat клеток (рис. 3). Assay может также обнаружить последовательности гена, которые высоко гомологичных для других членов семьи или видов, как показано на Revêchon и др., которые использовали короткий целевого анализа для выявления человеческого progerin, выраженные в мыши подкожной жировой ткани белых15. Кроме того малые ядрышковые РНК (snoRNA), ТРИФОСФАТЫ опосредованной гена редактирования и прекурсоров микроРНК могут быть обнаружены в situ с короткой целевой assay. Совсем недавно Фу et al. сочетаются этот assay иш IHC определить точные клеток в сетчатке, выражая в pre-miRNA mir125b16.

Мутация, профилирование в опухоли имеет решающее значение для изучения прогрессии опухоли и для разработки целевой терапии. Хотя мутация профилирования может быть достигнуто через высокопроизводительного секвенирования, эта технология не может полностью решить внутриопухолевых ссылку или неоднородность генетические изменения с клеточной морфологии17,18. Определение наличия мутаций точки, используя этот assay иш позволяет различия РНК последовательности с разрешением сингл база, как проверенных путем обнаружения EGFR L858R и КАРСТЕ G12A единичных нуклеотидных изменений в клеточных линиях (рис. 5). Кроме того Baker et al. используется Точечная мутация assay целевой несколько мутации онкогенов BRAF, крас и PIK3CA в18колоректального рака. Они были в состоянии выявлять и пространственно карта редких мутантов subclones опухолевых клеток, в конечном счете показаны, как они способствуют интра опухоль неоднородности.

В целом был разработан специализированный пробирного РНК ISH. Эта методология позволяет для обнаружения сращивания вариантов, коротких последовательностей, и мутации в situ. Это чувствительных, конкретных, поддающихся количественной оценке и адаптируемой производительности как ручной методами, так и на автоматизированных stainers.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Materials

HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) ACD 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II)
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) ACD 310012
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 ACD 310017
HybEZ Humidifying Paper ACD 310015
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)  Vector Laboratory  H-4000
SuperFrost Plus Slides (required)  Fisher Scientific  12-550-15
10% neutral-buffered formalin (NBF)  MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paraffin wax MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microtome MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Gill’s Hematoxylin I  American Master Tech Scientific/MLS  HXGHE1LT MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Xylene  Fisher Scientific/MLS X3P-1GAL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack  American Master Tech Scientific/MLS LWSRA24 MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Staining Dishes  American Master Tech Scientific/MLS LWT4457EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant  American Master Tech Scientific/MLS LWT4456EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
100% alcohol (EtOH)  American Master Tech Scientific/MLS ALREACS MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) Vector Labs  H-5000
Cover Glass, 24 x 50 mm Fisher Scientific/MLS  12-545-F MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Ammonium hydroxide, 28–30% Sigma-Aldrich/MLS 320145-500mL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Carboy (>3L) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer / /
Digital thermometer MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Pipettors and tips, 1–1000 μL MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Distilled water MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tubes (various sizes) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Fume hood MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Graduated cylinder MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Parafilm MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paper towel or absorbent paper MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microcentrifuge MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microscope and accessories MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Formaldehyde MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Histogel Fisher Scientific/MLS 22-110-678
BaseScope Reagent Kit – RED Advanced Cell Diagnostics 322900
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 Advanced Cell Diagnostics 701701
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 Advanced Cell Diagnostics 701711
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 Advanced Cell Diagnostics 701721
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 Advanced Cell Diagnostics 701731
BaseScope Hs-MET-E14E15 Advanced Cell Diagnostics 701811
BaseScope Hs-MET-E13E15 Advanced Cell Diagnostics 701801
BaseScope Hs-KRAS-G12A Advanced Cell Diagnostics 705491
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT Advanced Cell Diagnostics 705531
BaseScope Hs-EGFR-L858R Advanced Cell Diagnostics 705451
BaseScope Hs-EGFR-L858WT Advanced Cell Diagnostics 705461
BaseScope Control Probe Pack Human Advanced Cell Diagnostics 322975
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
  2. Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).
  3. Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
  4. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
  5. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  6. Paraffin processing of tissue. Protocols Online Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016)
  7. An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. , (2018).
  8. Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).
  9. Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).
  10. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).
  11. Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).
  12. Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).
  13. Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. , (2017).
  14. Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. , (2017).
  15. Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).
  16. Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).
  17. Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).
  18. Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).

Tags

Genetic VariantsShort TargetsPoint MutationsRNA In Situ HybridizationCell Type ExpressionSplice VariantsNeurociênciaOncologyExon JunctionsSensitivitySpecificitySingle CellsFormalin FixationParaffin EmbeddingMicrotome SectioningTarget RetrievalWash BufferHematoxylin CounterstainProbe HybridizationAmplification Reagents

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Anderson, C. M., Laeremans, A., Wang, X. M., Wu, X., Zhang, B., Doolittle, E., Kim, J., Li, N., Pimentel, H. X. Y., Park, E., Ma, X. Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay. J. Vis. Exp. (138), e58097, doi:10.3791/58097 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image