Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión
Summary
Aquí presentamos un protocolo para realizar polysome perfilado en el corazón de ratón perfundido aislado. Se describen métodos para la perfusión del corazón, polysome perfiles y análisis de las fracciones polysome mRNAs, miRNAs y el proteoma polysome.
Abstract
Estudios en cambios dinámicos en la traducción de la proteína requieren métodos especializados. Aquí examinamos cambios en las proteínas recién sintetizadas en respuesta a la isquemia y reperfusión con el corazón de ratón perfundido aislado juntado con perfiles polysome. Para entender más los cambios dinámicos en la traducción de la proteína, caracteriza los mRNAs que fueron cargados con los ribosomas citosólicas (Polirribosomas o polisomas) mitocondriales polisomas se recuperó y en comparación con la distribución de mRNA y proteína en la fracciones de alta eficiencia (numerosos ribosomas ARNm), baja eficiencia (menos ribosomas) mitocondriales polisomas, y las fracciones no traducir. también puede asociar miRNAs mRNAs que se están traduciendo, reduciendo así la eficiencia de la traducción, examinamos la distribución de los miRNAs a través de las fracciones. La distribución de proteínas, mRNAs y miRNAs fue examinada bajo condiciones perfusión basals, al final de 30 minutos de isquemia global sin flujo y después de 30 minutos de la reperfusión. Aquí presentamos los métodos utilizados para llevar a cabo este análisis, en particular, el enfoque de optimización de la extracción de la proteína de la gradiente de sacarosa, ya que esto no se ha descrito antes y algunos resultados representativos.
Introduction
El corazón responde a la lesión de isquemia (I) y (R) la reperfusión de manera dinámica. Sin embargo, hay poca penetración en cambios agudos en la síntesis de proteínas durante la respuesta. Para abordar esto, aprovechamos el método bien establecido de polysome perfiles1 para identificar los cambios en la abundancia de proteínas que reflejan la redistribución de los ribosomas y factores reguladores traslacionales de cytosol a polisomas, y la aumento de las proteínas recién sintetizadas (NSPs). En el marco de I / R, el aumento en la síntesis de proteínas nuevas se produce en un marco de tiempo que es inconsistente con la transcripción de mRNAs nuevo2; Además, la discordancia entre los niveles de expresión de mRNA y proteína abundancia ha sido reportado3. Por estas razones, hemos optado por analizar los cambios en el proteoma dinámico como se refleja por la traducción de proteínas. Para ello, cuantificar el mRNA en las fracciones polysome y analizar la composición de la proteína en las fracciones polysome. Por último, porque microRNAs (miRs) regulan la disponibilidad de los mRNAs para la traducción y puede interferir con la eficacia de la proteína traducción4,5, examinamos la distribución de miRs en las fracciones polysome, centrándose en la respuesta a me / r.
Optamos por utilizar el modelo de perfusión en ratones aislados Langendorff y tejido cosechada bajo condiciones basales de perfusión continua, después de isquemia caudal global de 30 minutos y después de 30 min de isquemia seguida de 30 minutos de la reperfusión. A continuación solubilizado el tejido del corazón y separa polisomas sobre un gradiente de sacarosa, seguido del análisis proteómico y detección selectiva de mRNAs y miRNAs mediante PCR y microarrays, respectivamente. Esta combinación de métodos representa un enfoque poderoso para entender el proteoma dinámico, que permite la detección simultánea de MARN, miRNA y NSPs, así como la redistribución de las proteínas reguladoras, miRNA y mRNA entre fracciones de nontranslating, baja eficiencia polisomas y polisomas de alta eficiencia (ver figura 1). Penetraciones en la regulación dinámica de este proceso se extenderá por más análisis de la fosforilación de factores reguladores claves eIF2α como mTOR. Continuación se describen estos pasos individuales en detalle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysome perfil análisis permite el estudio de la traducción de proteínas mediante el análisis del estado traslacional de un mARN específico o el transcriptoma conjunto6,7. También es de gran ayuda cuando traducción local debe estudiarse como sinaptosomas8. Tradicionalmente, este método implica la separación de mono – y Polirribosomas y los mRNAs asociados a un gradiente de sacarosa que podría acoplarse con genómica o proteómic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HL112730 NIH P01 (trapo, JVE), NIH R01 HL132075 (trapo, JVE), centro del corazón de la mujer de Barbra Streisand (trapo, JVE), Dorothy y Phillip Lyon E. Sillón en Cardiología Molecular (GAR), Erika Glazer dotado Cátedra salud del corazón de la mujer (JVE) y la Academia Checa de Ciencias Apoyo institucional RVO: 68081715 (MS).
Materials
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. | ||
Referências
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