Un High-throughput Cre-Lox attivato membrana virale Fusion test per identificare gli inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1

La necessità di terapie antiretrovirali romanzo ha richiesto lo sviluppo di schermi ad alta produttività per gli inibitori di HIV-1 entrata. L’analisi del reporter di Gag-iCre è stato sviluppato per identificare inibitori dell’entrata virale nella fase di fusione in un sistema di infezione della cellula–cellula misurando in particolare fusione della membrana virale con la membrana cellulare di host¹. Un’analisi è stata sviluppata alla schermata per nuovi inibitori che ha agito in particolare nelle fasi iniziali dell’infezione da HIV-1 fino al punto di fusione della membrana virale. Una sfida per l’infezione della cellula-cellula di misurazione è che l’inoculo iniziale contiene le cellule erogarici infetti e cellule bersaglio ininfected, quindi nuova infezione di misura è difficile discriminare dalle celle di input. Il sistema ideale comporterebbe un gene eterologo marcatore che può essere indotta dall’avvio di un’infezione di cella di destinazione e non è presente nella cellula donatrice. Un contenuto virale popolare saggio basato su una fusione di proteina-enzima virale, BlaM-Vpr, di miscelazione può essere efficace, ma ha limitazioni per throughput elevato, cella selezione². Questo test comporta un gene del reporter beta-lattamasi (BlaM) che è fusa a HIV-1 Vpr, confezionato in virioni e consegnato nelle celle di destinazione al momento della fusione della membrana virale. Il substrato CCF2-AM viene caricato nel citoplasma delle cellule bersaglio e subisce un cambiamento di fluorescenza su fenditura. Il substrato di CCF2-AM è costoso e può essere proibitivo per gli schermi ad alta velocità. Al fine di distinguere le cellule del donatore e di destinazione, è necessario tintura ecologica delle popolazioni. Infine, il protocollo richiede diversi passaggi di lavaggio e incubazione che possono essere gravoso e costoso quando si verifica un numero elevato di composti.

Il dosaggio di Gag-iCre è stato sviluppato come una soluzione a questi problemi, per sviluppare un high throughput screening per gli inibitori della fusione nella trasmissione della cellula–cellula. Questo sistema non richiede il substrato deve essere caricato nelle celle. Il metodo può essere utilizzato anche per gli studi senza cellula ed è adattabile ad altri studi di fusione virale usando le particelle del virus HIV-1 Gag-iCre pseudo-tipizzate. Saggi di fusione HIV Env mediata cellula-cellula possono misurare la fusione di virus Env proteina-mediata delle cellule, tuttavia questi non usano particelle di virus reale come il test di HIV-1 Gag-iCre^3,4,5. Questo test può essere letto con microscopia di flusso cytometry o fluorescenza. Esso è stato utilizzato con successo a schermo la libreria di FDA, nonché una piccola biblioteca di purinergic inibitori^1,6. Altri ricercatori hanno anche identificato purinergic inibitori in HIV-1 fusione usando un’analisi di fusione di alto-rendimento adattato e ottimizzato che segnala il trasferimento di virus-incapsulato beta-lactamase nel citoplasma^7,8 .

Il virus di Gag-iCre è stato progettato con un approccio simile al virus Gag-iGFP, inserimento di Cre ricombinasi tra matrice e capside, affiancato da HIV-1 proteasi siti⁹. L’enzima Cre è fatto come un precursore inserito all’interno della poliproteina Gag che matura quando proteasi HIV-1 sono attivato entro la particella virale nascente. La consegna di Cre dipende, quindi, la consegna del contenuto di una particella di HIV-1 proteasi-attivati in un bersaglio cellulare tramite un processo di fusione della membrana virale. Qui sono disponibili due versioni del protocollo. Il primo utilizza una popolazione di infezione da HIV-1 per infettare le cellule bersaglio, per studiare la trasmissione diretta di cellula–cellula dell’HIV. La seconda versione utilizza un virus senza cellula per studiare un’infezione virale senza cellula. Analisi della cellula–cellula trasmissione prende 7 giorni per essere completato dal giorno che le cellule vengono scongelate, o 5 giorni se le cellule sono già scongelate e attraversate. Il dosaggio di infezione senza cellula può essere effettuato in 5 giorni se le cellule devono essere scongelati e 3 giorni, se le cellule sono scongelate e attraversate. Vengono inoltre fornite istruzioni per generare una linea cellulare di destinazione (da rosso a verde) RG nel tipo di cella desiderata (se non viene utilizzata una preesistente linea cellulare di destinazione RG) utilizzando un plasmide creato dal Clevers Lab¹⁰. È consigliabile che biosicurezza adeguate precauzioni sono prese con il virus e le cellule che esprimono virus in questa analisi. Conduciamo la porzione infettiva di questo test in una struttura di coltura del tessuto BSL2 +. Dopo che le cellule sono fissi, essi possono essere analizzati in strutture di microscopia e citometria a flusso standard.

Qui descriviamo l’applicazione di questo test a schermo per romanzo composti che inibiscono la fusione della membrana virale di HIV-1 (Figura 1). Recettori purinergici sono mediatori pro-infiammatori. Il nostro laboratorio ha dimostrato che gli inibitori non selettivi dei recettori purinergici agiscono come inibitori di HIV-1 membrana virale vmware fusion⁶. Segnaliamo che l’utilizzo di questo test in alta velocità effettiva può identificare romanzo inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1. Dimostriamo che un inibitore della classe di recettori purinergici rappresenta una nuova classe di inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1.