JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Улитковый имплантат хирургии и записи ответ электрически вызывали слуховой мозга мышей C57BL/6

Published: January 09, 2019
doi:
10.3791/58073
, ,
1Hearing Systems Group, Department of Electrical Engineering,Technical University of Denmark, 2Brain and Sound Lab, Department of Biomedicine,Basel University

Summary

Животные модели кохлеарных имплантатов можно заранее знания технологических основ лечения постоянным нейросенсорной тугоухости с электрической стимуляции. Это исследование представляет хирургический протокол для острой оглушительный и кохлеарной имплантации массива электродов в мышей, а также функциональной оценки с ответом слуховой ствола мозга.

Abstract

Кохлеарных имплантатов (СНГ) являются neuroprosthetic устройств, которые могут обеспечить чувство слуха для глухих людей. Однако CI не может восстановить все аспекты слуха. Совершенствование технологии имплантатов необходима если CI пользователи воспринимать музыку и выполнить в более естественных средах, таких как слуха, голоса с конкурирующими говоруны, размышления и другие звуки. Такое улучшение требует экспериментальных животных, чтобы лучше понять механизмы электрической стимуляции в улитки и его ответы в целом слуховой системы. Мышь является более привлекательной модели из-за многих генетических модели доступны. Однако ограниченное использование этого вида как модель CI — главным образом из-за сложности имплантации массивы небольшие электродный. Подробнее о хирургической процедуры, поэтому представляет большой интерес для расширения использования мыши в исследованиях CI.

В настоящем докладе мы подробно описать протокол для острой оглушительный и кохлеарной имплантации массива электродов в штамм мыши C57BL/6. Мы продемонстрировать функциональную эффективность этой процедуры с электрически вызывали слуховой мозга ответ (eABR) и примеры лицевого нерва стимуляции. Наконец, мы также обсудить важность включения оглушительный процедуры при использовании обычно слушание животных. Эта модель мыши предоставляет мощные возможности для изучения генетических и нейробиологических механизмов, которые будут иметь значение для пользователей CI.

Introduction

Кохлеарных имплантатов (СНГ) являются электронными устройствами, которые могут обеспечить чувство слуха для людей с тяжелой и глубокой потерей слуха. Он использует электроды, хирургически имплантированных в улитки внутреннего уха прямо стимулирует слуховой нерв. На сегодняшний день, CI является наиболее успешных сенсорные протеза и помогла более чем 600 000 человек во всем мире1. Однако устройство имеет недостатки. Во-первых льготы, предоставляемые устройства различаются среди получателей. Во-вторых речи в шумных условиях и музыки до сих пор плохо воспринимаются большинством пользователей CI.

На протяжении многих лет были использованы Животные модели лучше понять эти вопросы в CI исследований и постоянно улучшать безопасность и эффективность устройств. Модели дали ценную информацию о нескольких явлений, таких как пластиковые изменения в мозге происходят после имплантации CI2, эффект применения генной терапии для сохранения остаточного слуха3и биофизические свойства электрически стимулирует слуховой нерв4, среди многих других примеров.

Мышей являются мощной модели организма из-за большого доступность генетических моделей глухоты. Другие преимущества включают возможность манипулировать геном мыши (например, через систему ТРИФОСФАТЫ-Cas), возможность использовать передовые методы для изучения механизмов, особенно в мозг, уровень высоких репродукций, быстрое развитие визуализации и легко, разведение и обработки. Основные технические проблемы в выполнении операций CI в мышей являются небольшой размер улитки и наличие большой stapedial артерии (SA). SA обычно исчезает во время эмбрионального развития человека, но сохраняется на протяжении всей жизни в ряде грызунов, в том числе мышей, крыс и песчанок. SA работает ниже круглое окно нишу, которая затрудняет доступ к улитки и увеличивает риск хирургического.

Предыдущие исследования показали возможность имплантации CI в мышей5,6,7. Ирвинг et al. продемонстрировали, что хронический intracochlear электрической стимуляции может быть достигнуто на срок до одного месяца. Острый стимуляции также была исполнена, но записи не были представлены. Они показали, что прижигание stapedial артерии не оказало существенного влияния на Порог слышимости или количество нейронов ганглия спираль и актуальным применение аминогликозидов неомицин, ототоксических наркотиков, был оглушительным эффективной процедуры в 5мышей. СОКЕН et al. описано изменение спинной подход к мыши улитки через круглое окно лучше сохранить слух статус6. После вставки провода платины иридий значительного остаточного слуха наблюдалось увеличение аудитории мозга ответ порог (ABR) 28 дБ. Otoacoustic выбросы (ОАЭ) были потеряны в животных с большими ABR порог смены6. Мистри et al. тестирование функциональные и гистопатологические эффекты имплантация при отсутствии электрической стимуляции7. Даже несмотря на то, что слух был сохранен в 3 и 6 месяцев old имплантированных мышей на низких частотах, имплантации привело фиброз как ткани вокруг имплантата и osteoneogenesis вокруг bullostomy7.

Короче говоря из трех исследований по СНГ в мышей, только один демонстрирует функциональные запись CI стимуляции. Ирвинг и коллеги выполнены оба острых и хронических eABR записей, но только показали данные от хронической стимуляции CI5. Однако хронический модель с полностью Имплантируемые устройства разработаны, Ирвинг et al. является технически сложным. Это еще не известно, если острый CI стимуляции, менее сложной и быстрее, можно достичь аналогичных результатов.

Люди с тяжелой и глубокой потерей слуха, которые больше не выгоду от слуховых аппаратов используются СНГ. Животные модели для CI пользователей должен поэтому включать оглушительный процедура обычно услышав что животные используются. Еще одна причина, чтобы оглушить животных слуха является электрическая стимуляция глухих и слуха улитки производит различные нейронных ответов4,8,9,10,11, 12. Электрическая стимуляция глухих улитки непосредственно активирует волокон слухового нерва и создает electroneural ответ (α). Он характеризуется короткой задержки и небольшой динамический диапазон в периферии8,10. С другой стороны электрической стимуляции слушания улитки также возбуждает клетки волос в ответ electrophonic (β), которая характеризуется больше задержки и больше динамический диапазон4,11. Ответ electrophonic приписывается нормальной возбуждения в нервных волокон, внутренние клетки волос, электрически индуцированных сокращение внешних волосковых клеток и поколения путешествия волны4. Electroneural и electrophonic ответы также привести два деятельности различных структур в центральной нервной системы9. Сато et al. записал нейронов мозга CI имплантированных морской свинки, до и после оглушительный с неомицин, который устраняет electrophonic вклад. Они показали, что наклон-уровня функции был круче и стрельбы ставки в состояние оглушен выше по сравнению с слушания условие9. Таким образом в зависимости от исследования вопрос заявил, важно рассмотреть вопрос о включении оглушительный отдельных electrophonic и electroneural ответы на электрическая стимуляция слухового нерва.

Здесь мы описываем процедуры для острой оглушительный и кохлеарной имплантации массива электродов в мыши, а также функциональная запись intracochlear электростимуляция с электрически вызывали слуховой мозга ответ (eABR).

Protocol

Все процедуры были проведены согласно Базельского университета, Швейцария, Уход за животными и руководящие принципы. Они были лицензированы управлением ветеринарных кантона Базель, Швейцария. Примечание: Взрослых мышей C57Bl/6, в возрасте 8-12 недель (вес 20-30 г), были использованы в этом исследовании.Левое ухо используется в качестве экспериментальной уха. Правое ухо служит элемент внутри животных и не изменен хирургическим путем. 1. предоперационная процедуры Обезболивают животных 30 мин до операции через инъекции внутри брюшной полости (и.п.) кетамина/Ксилазина (80 мг/кг кетамин, Ксилазина 16 мг/кг, и.п., объем, вводят в 10 мкл/г веса тела). Дополнить анестезии при необходимости, как судить положительных педаль и глазной рефлекс (мыс пинча) и движения усов, с низкой дозы кетамина (45 мг/кг, и.п., вводится в 10 мкл/г веса тела). Агенты и доза режимов может быть заменен на институциональных руководящих принципов.Примечания: В общем, животное понадобится инъекции каждые 45-60 мин с этим режимом агент и дозы. Среднее время от первоначального разреза к закрытию вокруг массива имплантированных электродов обычно составляет 1-1,5 часа. Проверка для полного успокоения животного, отмечен регулярного дыхания ставки и отсутствие мыс щепотка рефлексов. Поддерживать этот уровень анестезии. Поддерживать температуру тела животного на 36,6 ° C с замкнутой грелку. Примените Глазную мазь, чтобы избежать обезвоживания роговицы. Это также будет подавлять животного мигать рефлекс, который можно добавить шум по перекодирования. Управление местным обезболивающим через подкожные инъекции (с.к.) бупивакаин/лидокаина (бупивакаин 0,1 мг/мл и 0,4 мг/мл лидокаина, 0,1 мл ведении s.c.) вдоль линии предполагаемого разреза, чтобы свести к минимуму дискомфорт хирургического. Агенты и доза режимов может быть заменен на институциональных руководящих принципов. Администрировать антагонистом мускариновых атропина (atropinesulfate аминокислот, 0.1 мг/мл, 20 мкл ведении s.c., растворенного в PBS) в шею уменьшить выделение слизи и облегчения дыхания. Агенты и доза режимов может быть заменен на институциональных руководящих принципов. 2. предварительно оглушительный акустическая слухового ответа ствола мозга (слуховой) Примечание: слуховой используется для измерения хода слушаний до и после оглушительным. Испытания проводятся на левом ухе и звукоизолированные электрически экранированные кабины. Мы рекомендуем протестировать и позднее имплантата левого уха для правша. Более подробная информация о ABR мышей можно найти в13,14. Такер Дэвис технологий (TDT) аппаратного и программного обеспечения (BioSig) используются для записи ABR, но другие системы могут быть использованы. Блокировать контралатеральной уха (справа) с акустической пены изоляции ABR ответ от ипсилатеральные уха (слева). Пена в 1 мл шприц и вставляют его правый канал уха мыши, чтобы покрыть весь канал уха с пеной (0,1 – 0,2 мл пены). Убедитесь шприц уплотнения тесно в ухо так, чтобы пена получает всю дорогу в ушной канал. Место спикера 10 см от левого уха.Примечание: Динамик для этой установки был откалиброван с помощью микрофона ПХД, как описано в refefence15. Очистите электроды ABR с 70% этанола раствор. Место электродов под кожу: активный (Ch1) на вершины, ссылка ниже Пинна ипсилатеральные уха (-) и в задних ног (рис. 1). Подключите к слуховой процессор через порт волоконно головы стадии и предварительный усилитель. Проверьте сопротивление активной и электрод сравнения. Если импеданс свыше 3 ом, упорядочить их и заново произвести измерение. Лучшие записи получаются, когда электроды имеют же сопротивление. Закройте-звукоизоляционные стенд. Настоящее время нажмите стимуляции и записывать ABR в условиях свободного поля с сложной аудитории процессор и программное обеспечение. Стандартизировать нажмите раздражитель в программном обеспечении: 0,1 мс монофазными одноканальном клики представлены 21 Гц; Щелкните уровень уменьшается от 90 дБ в радиусе до 10 дБ SPL в 10 дБ; 10 мс, записи окна. Средняя в общей сложности 512 ответов на каждом уровне dB. Примените фильтр нижних частот 2000 Гц и фильтр фильтр 300 Гц автономной уменьшить шум в записи, с помощью сценария на заказ Matlab. Определите порог ABR, как низкий уровень дБ с узнаваемым ответ волны ABR (рис. 2, рис. 3). 3. хирургия Примечание: Типичные инструменты, используемые включают ножниц, скальпель, пара металлические щипцы с прямыми или изогнутыми советы, ткани втягивающего инструмент, несколько всасывания дольками и рассасывающиеся бумажным штифтом. Операция проводится на левом ухе. Поместите указатель мыши на его правой стороне. Избегайте ненужных крутильных стресса на шейных позвонков. Убедитесь в том держать тело прямо к держать дыхательные пути открытыми. Вырезать мех за левым ухом с ножницами (или остричь ее с бритвы) подвергать кожу. Стерилизуйте кожи с 70% этанола раствор и Бетадин (повидон/йода). Под микроскопическим увеличением (16 x) сделайте пост аурикулярных разрез 1 – 1,5 см с скальпель. Переключиться на микроскопические увеличение (25 x). Выполните тупым рассечение через подкожный жировой слой, который может быть различной толщины, с щипцами.Примечание: Будьте осторожны, когда вскрывали как внешние яремной пересекает этой области. Повреждение к этой структуре может вызвать чрезмерное кровотечение. Убрать ключично мышцы, чтобы раскрыть барабанные буллы надкостницы. Используйте лицевого нерва как ключевой анатомические ориентир для помощи идентификации слуховой буллы. Лицевого нерва обертывания вокруг задней/дорсальном крае ключично мышцы и рострально проходит вдоль канала уха к Пинна. Осторожно поместите средство самостоятельного сохранения втягивающего устройства в разрез для облегчения доступа к буллы (рис. 4). Удаление ткани вышележащих Медио спинной области буллы разрешить четкой визуализации хребта между Булла и сосцевидного отростка. Осторожно поверните иглой 30 G для прокалывания буллы и сделать отверстие (bullostomy) на задней Улучшенный стороне хребта (кость тоньше на этой стороне). В качестве альтернативы используйте Стоматологические хирургические сверла.Примечание: Этот и следующие шаги можно сделать с даже микроскопические увеличение (40 x), если предпочтительнее. Кроме того измените положение микроскопа при необходимости. Это важно для максимизации хирургические представление пространства среднего уха. Расширьте bullostomy, щипать малых костей куски с помощью тонкой наконечником щипцы подвергать полость среднего уха. Расширение bullostomy дорсально к сосцевидного отростка до круглое окно ниша подальше от вышележащих кости. Stapedial артерии, филиал внутренней сонной артерии, проходит вентральной нишу круглое окно. Будьте осторожны, чтобы не повредить судно как чрезмерное кровотечение может быть фатальным. Небольшое кровотечение может быть остановлена нажатием небольшой кусок сотрудничестве в полость внутреннего уха. Расширение bullostomy к направлению передней превосходный для визуализации стремени, костей среднего уха, подключенных к овальное окно. Удаление стремени пинцетом подвергать овальное окно. 4. круглое окно применение ототоксических агента Аккуратно перфорировать круглые окна и овал мембраны, притупляются иглой 30 G. Проверьте что перилимфе иссякнут. Медленно perfuse 0,05% вес/объем неомицин, растворенных в PBS (скорректирована с рН 7,4) через овальное окно. Жидкость должна флеш из круглое окно. Повторите ту же процедуру на круглое окно. Будьте осторожны, чтобы не повредить окна костных структур с иглой для perfuse. Место небольшой кусок (1 мм2) сотрудничестве пропитанной неомицин в течение раунда окна и овал нишу. Удалите средство втягивающего, закрыть разрез и подождите 30 минут. 5. После оглушительный акустическая ABR Запись слуховой подобным образом до оглушительный (шаги 2,2 до 2,8) (Рисунок 2Б, рис. 3). 6. Включение CI электрода массива Примечание: Intracochlear электрод массив состоит из четырех полос платины (Ø0.2 мм) с Платина/радужки парилена изолированные провода, экранированный в силиконовой трубки (рис. 5). Поместите инструмент втягивающего устройства в разрез для повторного доступа к буллы. Вставьте массив электрода в круглое окно (Скала литавры) на глубине где 4й Платиновый Кольцо расположен только внутри круглое окно. Это дает вставки глубина ~ 2, соответствует позиции intracochlear в ~ 30 кГц16мм. Катушка свинца проволоки внутри буллы и приклейте провода к ткани выше буллы. Намотка проволоки помогает сохранить массив на месте на протяжении всего эксперимента. Осторожно удалите втягивающего устройства и закройте вставки с клеем ткани. Сделать небольшой надрез (0.5 мм) в шею перпендикулярно линии между где активные и электроды ABR ссылка будет использовать ткань ножницами. Место Платиновый земли мяч в подкожной карман и закрыть небольшой разрез с клея ткани (рис. 6). Подключите Совет массив электрода к платформе стимулятор животных. 7. электрические слухового ответа мозга (eABR) Примечание: Животное стимулятор платформы (ASP) используется для электрически стимулировать массив электрода. Могут использоваться другие источники тока и программных систем. Место ABR электроды как раньше (шаги 2.3 до 2.5) (рис. 6). Откройте ASP программного обеспечения и определить электроимпульсной стимуляции парадигмы. Мы используем заряда сбалансированный двухфазные импульсы с 50 μs/фаза и 10 мкс межфазное разрыв, представлены на 23,3 импульсов в секунду (pps). Электрическая стимуляция поставляется в конфигурации монополярный электрод с увеличением текущие уровни. В общей сложности 400 ответов в среднем на каждом текущем уровне. Настоящее время поезда электрического импульса и записать ответ вызвал eABR непрерывно через TDT headstage, предварительный усилитель и слуховой процессор. Сюжет и анализировать данные eABR через заказные matlab скрипт (рис. 7). Сценарий и пример записи предоставляются в дополнительного механизма. 8. конец эксперимента В конце эксперимента усыпить животных согласно институциональных руководящих принципов. Осторожно открыть разрез и удалить имплантат. Ультра sonicate электрод массив в дистиллированной воде 10 мин для удаления мусора ткани.Примечание: Имплантат может быть использован несколько раз, если электроды нетронутыми и должным образом проведение. Чтобы проверить это, измерьте сопротивление электродов с мультиметром, когда массив сухой. Храните в сухом месте массив электрода.

Representative Results

Целью данного исследования было описать надежная модель для острой CI стимуляции в оглушен мыши. Пред- и послеоперационные слуха порогов служил функциональной индикация оглушительный процедуры. Актуальным применение 0,05% неомицина в окне овальной и круглой значительно увеличились 46 дБ ± 6 порогов нажмите вызывали слуха (предварительно против пост неомицин: 30,0 дБ ± 3,8 против 75,7 дБ ± 3.7, p = 0.0003, паре t теста, n = 7) (рис. 3). Массив размера мыши электрода далее был вставлен в круглое окно (Рисунок 4, рис. 5). Электрические моделирование intracochlear электрода может надежно вырабатывают eABR активность. (Рис. 7). В некоторых случаях, CI стимуляции активируется лицевого нерва и производства высокой амплитуде волны с короткие или длинные задержки (рис. 8A и Рисунок 8B, соответственно). Короткие задержки отклика было характерно быстрое усиление волны IV около 3 МС и может быть прямым ответом лицевого нерва. Длинные задержки отклика появилась около 5-6 мс и скорее всего не слуховой мышц (миогенных) ответ косвенно вызванные лицевого нерва. Лицевого нерва ответы редко сообщается в исследованиях на животных в литературе, но хорошо известных осложнений в человека CI пользователей17,18,19. В Рисунок 8, лицевого нерва стимуляции появилась на относительно средних текущих уровнях (150 – 200 МКА) и в двух различных животных. В других случаях обе реакции может появиться в то же самое животное на очень высокие уровни (не показан). Рекомендуется ограничить текущего уровня до уровня ниже вид лицевого нерва стимуляции. Рисунок 1: Настройка слухового ответа мозга (ABR). Подкожных электроды расположены на вершины (активный/канал 1 [каналы 1]), за ухом ипсилатеральной (ссылка [Ref]) и задняя нога (Земля [Gnd]) наркотизированных мыши. Электрод сигналы усиливаются и затем Записанная системой TDT. Акустическая и электрическая стимуляция представлены через микрофон и животных стимулятор платформы, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: представитель слуховой волны нажмите стимуляции от дикого типа мыши до и после оглушительный с 0,05% неомицина. (A) нормальный слух слуховой шаблон характеризуется волны, помечены-V и порог низкий слуха, здесь 30 дБ SPL (стрелка). (B) оглушен слуховой шаблон показывает увеличение слуха порог, здесь 70 дБ SPL (стрелка). Волны имеют больше времени задержки и более временного джиттера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: слуховой порог до и после оглушительным. Применение неомицин значительно увеличился 46 дБ ± 6 слуховой порогов. После предварительной против неомицин: 30,0 дБ ± 3,8 против 75,7 дБ ± 3.7, p = 0.0003, паре t теста, n = 7. Ошибки — стандартная ошибка средств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: хирургия. (A) воздействия на аудиторию буллы. Bullostomy это выполняется (белый пунктирной окружности) вдоль хребта на барабанные буллы (черная пунктирная линия). (B) bullostomy позволяет визуализировать круглые окна, stapedial артерии и овальное окно. Неомицин-нежно промыта первой овальное окно, а затем круглое окно. Массив (C) электрод вставляется до тех пор, пока 4й электрод расположен только внутри ниши круглое окно. Сварочная проволока свернувшись внутри буллы сохранить массива на месте, прежде чем разрез закрыт. CN VII = черепного нерва VII (лицевого нерва), вл = овальное окно, RW = раунд окна, SA = stapedial артерии, SCM = ключично мышц, ТБ = барабанные буллы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5: мыши кохлеарного импланта. (A) intracochlear электрод массив состоит из четырех платины полос, расположенных в интервале 0,4 мм с диаметром d: 0 [отзыв] (d = 0,21), 1 (d = 0,23), 2 (d = 0,25), 3 (d = 0,27). Ширина каждого электрода-0,2 мм. Четыре провода платины/Иридиум (90/10) парилена изоляцией защищены в силиконовой трубки. (Б) увеличение массива электрода (красная пунктирная площадь). Массив электрода и Платиновый ведения мяча подключены к печати Совета. Шкалы бар = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6: установки электрически вызывали ABR (eABR). CI Платиновый земли мяч (Gnd, красный) помещается в кармане подкожно в шею мыши. Линии между активной (Ch1(+) на вершины) и ссылка (Ref (-) на ипсилатеральной уха) ABR электроды перпендикулярно линии между электродом массив и землю для того, чтобы получить лучший ответ eABR. Электрод eABR Земля (Gnd, черный) помещается в заднюю ногу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 7: представитель eABR волн для стимуляции CI в оглушен мыши. Двухфазный импульсов представлен электрода #1 в монополярной конфигурации на 23,3 импульсов в секунду (pps) с 400 повторений. Раздражители уровень 0-175 μA показан 25 μA шаги (см. детали стимуляции в шаг 7.2). Римские цифры обозначают eABR волновых чисел. Амплитуды волны и латентность увеличения и уменьшения, соответственно, с увеличением текущего уровня. В этом примере, волна II появились около 1 мс, волна III около 2 мс, волны IV около 3 МС, волна V около 4 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 8: пример лицевого нерва стимуляции. В некоторых случаях CI стимуляции может активировать лицевого нерва и вызывают прямой ответ с короткой задержкой (A) (стрелка) или косвенный ответ с дольше задержка (B) (стрелка). Приведенные примеры являются из двух животных, CI-имплантированные стимулируется с двухфазными импульсов с помощью 0-300 μA 50 μA шагов (см. детали стимуляции в шаг 7.2). Римские цифры обозначают eABR волны чисел. * обозначает отсечения eABR волны благодаря насыщению усилителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Эта рукопись описывает хирургический подход для острой оглушительный и кохлеарной имплантации в мыши, а также функциональной оценки CI стимуляции с ответом слуховой ствола мозга. Хотя мыши улитки является небольшим и сложной операции, модель мыши CI осуществимым и служит ценным инструментом в слуховой области исследований.

Stapedial артерии присутствует в среднем ухе мыши. Артерии входит буллы кзади медиально и проходит книзу в круглое окно нишу и затем главно овальное окно нишу. В процессе первоначальной разработки модели мыши мы испытали роковой интраоперационная кровотечения следующие травмы stapedial артерии, главным образом при доступе к буллы. Как следствие мы адаптированы более ограниченный подход и доступ буллы в небольших, изысканный рассечение шаги. Без дальнейших осложнений из-за кровотечения после этого наблюдались. Несмотря на тот факт, что stapedial артерии прижигания имеет статистически значимого влияния на Порог слышимости или количество нейронов ганглия спираль в мышей5, на наш взгляд это ненужным, до тех пор, пока большой заботы и внимания принимаются во время операции. Мы рекомендуем принимать необходимое время для тонкой психомоторных навыков и достичь технические знания. Среднее время от первоначального разреза к закрытию вокруг массива имплантированных электродов обычно составляет 1 – 1,5 ч.

Описанные острой CI хирургии в мышах похож на «вентральной» процедуры и круглое окно вставки, используемые в других грызунов, в том числе крыс и песчанок20,21,22. Другие грызунов исследования использовали «спинной подход» с базальной поворот cochleostomy вместо круглое окно вставки, избегая SA полностью и вставка массив более глубоко6,23,24. Имплантация хронической стимуляции Ассамблеи в мышах следует те же шаги, как описано в этом протоколе с добавлением Dacron сетки, чтобы исправить имплантата и послеоперационный уход5.

Основные технические проблемы при выполнении операции CI в мышей являются небольшой размер улитки, по сравнению с улитки крыс и песчанки и наличие большой SA. SA присутствует также в крыс, но не в песчанок. Кроме того поскольку мышей, меньше, чем крысы и песчанки, они более уязвимы для хирургических процедур.

Чтобы устранить electrophonic ответы в eABR записи и имитировать волосы ячейка потерь найден в большинство пользователей CI, мы оглушен животных перед вставкой CI. Мышей трудно Заглушающая ototoxically в естественных условиях25 , потому что системные концентрации аминогликозидов, требуется вызвать ототоксичность имеет узкий дозы окно: снижение дозы отданы несколько дней приводит к потери волос клеток, тогда как одной инъекции более высокие дозы могут быть смертельной26. Кроме того подверженность аминогликозидов является штамм зависимых26. Однако было показано, что разовая доза аминогликозидов в сочетании с мочегонным цикла может производить чрезмерного внешнего клетки волос потери в АЗВ/АКЮ мышей без фатальных последствий27. Смерть задержки внутренний клетки волос было сообщено в половине из всех cochleae рассмотрел27.

В этой рукописи мы использовали местное применение аминогликозидов неомицин Вдохновленный недавно создана для мышей C57BL/65протокола. Острый применение неомицина значительно увеличить порог слышимости вызывали нажмите на 46 дБ ± 6,1. Хотя это увеличение больше чем 35 дБ увеличение сообщили, Ирвинг и др. (предварительно против послеоперационный: 41.6 дБ ± 3.3 против 76,6 дБ ± 4,4, p = 0,02, n = 3) 5, мы достигли же пост оглушительный порог (75,7 dB 3.7 против 76,6 дБ ± 4,4). считается, что неомицин 0,05% к частичной потере слуха, главным образом, смерти быстрое внешние клетки волос, как внутренние клетки волос потери занимает больше времени, чтобы произойти27. Поэтому вполне возможно что electrophonic ответа, который создается как внутренняя и внешняя клетки волос4,8,9,10,11,12, только частично устранены в оглушен животных с остаточного слуха. Даже несмотря на то, что неомицин 0,05% (вес/объем) не уменьшается количество нейронов ганглия спираль 4 недели после оглушительный5, это еще неизвестно, если неомицин в нашей острой установки влияет волокон слухового нерва или способствует synaptopathy (потеря синапсов между внутренней клетки волос и типа я слухового нерва волокон). Еще один фактор неопределенности является, что актуальные неомицин лечение не может произвести равномерное распределение волос ячейка потерь по длине улитки. Будущие исследования должны ответить на эти вопросы.

В резюме растущее количество генетических моделей для человеческого слуха и биохимические имеющиеся инструменты сделать мыши модель привлекательной животных для слухового исследований, в том числе области СНГ.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Пьер Stahl, дополнительных медицинских, Ницца, Франция, за обеспечение животных стимуляции платформы и советы по стимуляции парадигмы и Джеймс б. Фэллон и Эндрю K. Wise Бионика института, Мельбурн, Австралия, хирургические советы . Эта работа была поддержана грант от Швейцарский Национальный научный фонд (передачи грантов ЕИС до T.R.B.).

Materials

Hardware
Sound-proof booth IAC Acoustics, Winchester, UK Mac-2 Enclosure RF Shielded Box 2A
MF1 Speaker Tucker Davis Technologies (TDT), FL, USA
PCB microphone PCB Piezotronics, Inc, NY, USA Model 378C01
Low impedance headstage TDT, FL, USA RA4LI
Medusa pre-amplifier TDT, FL, USA RA4PA
RZ6 auditory processor TDT, FL, USA
Animal Stimulator Platform ASP, Oticon Medical, Nice, France
Multimeter Fluks #115
Surgical equipment
Closed-loop heating pad FHC, Inc. ME, USA
Eye ointment Alcon, CH Lacrinorm Augengel
Acoustic foam Otoform Ak, Dreve Otoplastik GmbH #464
Disposable subdermal needle electrodes Horizon, Rochester Electro-Medical Inc. S83018-R9, 27G
Self-retaining retractor tool (Mini Collibri Retractor) Fine Science Tools #17000-01
Suction wedges Agnthos, SE #42-886-460
Absorbable paper point (Medium) WPI, FL, USA #504182
Intracochlear electrode array Bionics Institute, Melbourne, Australia 4 channel
Spongostan Standard Ferrosan Medical Devices #MS0002
Tissue glue. Loctite 4161 Superbond Henkel Part No 19743
Animal Stimulator Platform (ASP) Oticon Medical, Nice, France
Drugs/chemicals
Ketamine (Narketan) Provet AG, CH 100mg/mL, #VQ_320265
Xylazine (Rompun) Provet AG, CH Inj Diss 2%, # 1315
Bupivacaine Compendium, CH Bupivacain Sintetica inj Diss 0.5%
Atropine (Atropinesulfat Amino) Amino AG, CH 1 mg/ml
Betadine (Povidone/iodine) Provedic, CH
Neomycin (Neomycin trisulfate salt) Sigma N1876-25G, Lot#WXBB7516V
Software
BioSigRZ TDT, FL, USA
Matlab MathWorks, MA, USA
ASP software Oticon Medical, Nice, France
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. The-Ear-Foundation. . Cochlear Implants Update. , (2018).
  2. Fallon, J. B., Irvine, D. R. F., Shepherd, R. K. Cochlear Implants and Brain Plasticity. Hearing Research. 238 (1-2), 110-111 (2008).
  3. Pfingst, B. E., et al. Neurotrophin Gene Therapy in Deafened Ears with Cochlear Implants: Long-term Effects on Nerve Survival and Functional Measures. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (6), 731-750 (2017).
  4. Miller, C. A., et al. Electrical excitation of the acoustically sensitive auditory nerve: single-fiber responses to electric pulse trains. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 7 (3), 195-210 (2006).
  5. Irving, S., et al. Cochlear implantation for chronic electrical stimulation in the mouse. Hearing Research. 306, 37-45 (2013).
  6. Soken, H., et al. Mouse cochleostomy: a minimally invasive dorsal approach for modeling cochlear implantation. Laryngoscope. 123 (12), E109-E115 (2013).
  7. Mistry, N., Nolan, L. S., Saeed, S. R., Forge, A., Taylor, R. R. Cochlear implantation in the mouse via the round window: effects of array insertion. Hearing Research. 312, 81-90 (2014).
  8. Hartmann, R., Topp, G., Klinke, R. Discharge patterns of cat primary auditory fibers with electrical stimulation of the cochlea. Hearing Research. 13 (1), 47-62 (1984).
  9. Sato, M., Baumhoff, P., Kral, A. Cochlear Implant Stimulation of a Hearing Ear Generates Separate Electrophonic and Electroneural Responses. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 54-64 (2016).
  10. Pfingst, B. E., Spelman, F. A., Sutton, D. Operating ranges for cochlear implants. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 89 (2), (1980).
  11. Miller, C. A., Hu, N., Zhang, F., Robinson, B. K., Abbas, P. J. Changes across time in the temporal responses of auditory nerve fibers stimulated by electric pulse trains. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 9 (1), 122-137 (2008).
  12. Shepherd, R. K., Javel, E. Electrical stimulation of the auditory nerve. I. Correlation of physiological responses with cochlear status. Hearing Research. 108 (1-2), 112-144 (1997).
  13. Akil, O., Oursler, A. E., Fan, K., Lustig, L. R. Mouse Auditory Brainstem Response Testing. Bio Protocol. 6 (6), (2016).
  14. Willott, J. F. Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 8 (Unit 8.21B. , (2006).
  15. TDT. . ABR User Guide: A Guide to ABR Testing with the System 3 RZ6. , (2017).
  16. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
  17. Cushing, S. L., Papsin, B. C., Gordon, K. A. Incidence and characteristics of facial nerve stimulation in children with cochlear implants. Laryngoscope. 116 (10), 1787-1791 (2006).
  18. Berrettini, S., Vito, D. A., Bruschini, L., Passetti, S., Forli, F. Facial nerve stimulation after cochlear implantation: our experience. Acta Otorhinolaryngologica Italica. 31 (1), 11-16 (2011).
  19. Hu, H., Kollmeier, B., Dietz, M. Reduction of stimulation coherent artifacts in electrically evoked auditory brainstem responses. Biomedical Signal Processing and Control. 21, 74-81 (2015).
  20. Wiegner, A., Wright, C. G., Vollmer, M. Multichannel cochlear implant for selective neuronal activation and chronic use in the free-moving Mongolian gerbil. Journal of Neuroscience Methods. 273, 40-54 (2016).
  21. Hessel, H., et al. Meriones unguiculatus (Gerbil) as an animal model for the ontogenetic cochlear implant research. American Journal of Otolaryngology. 18 (S21), (1997).
  22. Pinilla, M., Ramirez-Camacho, R., Jorge, E., Trinidad, A., Vergara, J. Ventral approach to the rat middle ear for otologic research. Otolaryngology Head Neck Surgery. 124 (5), 515-517 (2001).
  23. King, J., Shehu, I., Roland, J. T., Svirsky, M. A., Froemke, R. C. A physiological and behavioral system for hearing restoration with cochlear implants. Journal of Neurophysiology. 116 (2), 844-858 (2016).
  24. Lu, W., Xu, J., Shepherd, R. K. Cochlear implantation in rats: a new surgical approach. Hearing Research. 205 (1-2), 115-122 (2005).
  25. Poirrier, A. L., et al. Ototoxic drugs: difference in sensitivity between mice and guinea pigs. Toxicology Letters. 193 (1), 41-49 (2010).
  26. Wu, W. J., et al. Aminoglycoside ototoxicity in adult CBA, C57BL and BALB mice and the Sprague-Dawley rat. Hearing Research. 158 (1-2), 165-178 (2001).
  27. Taylor, R. R., Nevill, G., Forge, A. Rapid hair cell loss: a mouse model for cochlear lesions. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 9 (1), 44-64 (2008).

Tags

Cochlear ImplantAuditory Brainstem ResponseC57BL/6 MiceDeafeningCochlear ImplantationAcute DeafeningFunctional AssessmentCochlear Implant SurgeryAuditory Brain Stem ResponseHearing LossElectric StimulationAnimal ModelStapedial ArteryRound Window NicheClick StimulusAVR Threshold

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Navntoft, C. A., Marozeau, J., Barkat, T. R. Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (143), e58073, doi:10.3791/58073 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image