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Neurociência

Implant cochléaire et les enregistrements de réponse électriquement évoqué auditif du tronc cérébral chez les souris C57BL/6

Published: January 09, 2019
doi:
10.3791/58073
, ,
1Hearing Systems Group, Department of Electrical Engineering,Technical University of Denmark, 2Brain and Sound Lab, Department of Biomedicine,Basel University

Summary

Modèles animaux des implants cochléaires peuvent faire avancer les connaissances des bases technologiques de traiter la surdité permanente avec une stimulation électrique. Cette étude présente un protocole chirurgical pour assourdissant aiguë et de l’implantation cochléaire d’un tableau d’électrode dans la souris ainsi que l’évaluation fonctionnelle avec réponse auditif du tronc cérébral.

Abstract

Les implants cochléaires (CIs) sont des dispositifs de NEUROPROTHÉTIQUES qui peuvent fournir un sens de l’ouïe aux sourds. Toutefois, un CI impossible de restaurer l’intégralité de l’audience. Amélioration de la technologie des implants est nécessaire si les utilisateurs de CI sont à percevoir la musique et de fonctionner dans des environnements plus naturels, tels que l’audience sur une voix avec des affichettes concurrentes, réflexions et autres sons. Cette amélioration nécessite des animaux de laboratoire afin de mieux comprendre les mécanismes de stimulation électrique dans la cochlée et ses réponses dans le système auditif ensemble. La souris est un modèle de plus en plus attrayant en raison des nombreux modèles génétiques disponibles. Cependant, l’utilisation limitée de cette espèce comme un modèle CI est principalement due à la difficulté d’implantation des baies de petite électrode. Plus de détails sur cette intervention chirurgicale sont par conséquent d’un grand intérêt à étendre l’utilisation de la souris dans la recherche de CI.

Dans ce rapport, nous décrivons en détail le protocole pour assourdissant aiguë et de l’implantation cochléaire d’un tableau d’électrode dans la souche de souris C57BL/6. Nous démontrer l’efficacité fonctionnelle de cette procédure avec réponse électriquement évoqué auditif du tronc cérébral (eABR) et montrent des exemples de la stimulation du nerf facial. Finalement, nous discutons également l’importance d’inclure une procédure assourdissante lorsque vous utilisez une audience normalement animal. Ce modèle de souris offre une occasion puissante pour l’étude des mécanismes génétiques et neurobiologiques qui seraient utile pour les utilisateurs de CI.

Introduction

Les implants cochléaires (CIs) sont des dispositifs électroniques qui peuvent fournir un sens de l’ouïe aux personnes ayant une déficience auditive grave et profonde. Il utilise des électrodes implantées chirurgicalement dans la cochlée de l’oreille interne pour stimuler directement le nerf auditif. A ce jour, le CI est la prothèse sensorielle plus réussie et a aidé plus de 600 000 personnes dans le monde1. Toutefois, le dispositif présente des lacunes. Tout d’abord, les prestations prévues par le dispositif varient considérablement entre les bénéficiaires. Deuxièmement, discours dans des environnements bruyants et la musique sont encore mal perçues par la plupart des utilisateurs de CI.

Pendant de nombreuses années, des modèles animaux ont été utilisés afin de mieux comprendre ces questions dans la recherche de CI et d’améliorer sans cesse la sécurité et l’efficacité des dispositifs. Les modèles ont donné de précieuses informations sur plusieurs phénomènes, tels que les changements en plastique dans le cerveau qui se déroulent après CI implantation2, l’effet de l’application de la thérapie génique pour préserver l’audition résiduelle3et propriétés biophysiques de la stimulé électriquement le nerf auditif4, parmi beaucoup d’autres exemples.

Les souris sont un organisme modèle puissant en raison de la grande disponibilité des modèles génétiques de la surdité. D’autres avantages incluent la possibilité de manipuler le génome de la souris (par exemple, via le système CRISPR-Cas), la possibilité d’utiliser advanced imaging techniques afin d’étudier les mécanismes, en particulier dans le cerveau, le taux de reproduction élevé, un développement rapide et reproduction facile et la manipulation. Les principaux défis techniques en effectuant des chirurgies de la CI chez les souris sont la petite taille de la cochlée et la présence d’une grosse artère stapédiens (SA). La SA généralement disparaît durant le développement embryonnaire chez l’homme mais persiste tout au long de la vie dans un certain nombre de rongeurs, y compris les gerbilles, les rats et les souris. La SA passe sous la niche de la fenêtre ronde, qui complique l’accès à la cochlée et augmente le risque chirurgical.

Études antérieures ont montré la faisabilité de l’implantation de la CI en souris5,6,7. Irving et coll. ont démontré que la stimulation électrique chronique intracochlaire est possible jusqu’à un mois. La stimulation aiguë a également été effectuée, mais les enregistrements n’ont été présentées. Ils ont montré que la cautérisation de l’artère stapédiens n’eu aucun effet significatif sur le seuil de l’audition ou le nombre de neurones du ganglion spiral et que l’application topique de la néomycine aminoside, un médicament ototoxique, était une procédure efficace assourdissante dans souris5. Soken Al décrit une approche dorsale modifiée à la cochlée de souris par le biais de la fenêtre ronde pour mieux préserver audience statut6. Après l’insertion d’un fil de platine-iridium, audition résiduelle importante a été observée, avec une réponse accrue auditif du tronc cérébral, seuil (ABR) de 28 dB. Émissions oto-acoustiques (EOA) ont été perdues chez les animaux avec grand ABR seuil déplacements6. Mistry Al testé les effets histopathologiques et fonctionnelles de l’implantation en l’absence de stimulation électrique7. Même si l’audience a été préservée dans les 3 à 6 mois-vieille souris implantés dans les basses fréquences, l’implantation a abouti à la fibrose tissu autour de l’implant et osteoneogenesis autour de la bullostomy7.

Bref, hors les trois études sur CIs chez la souris, seul montre enregistrement fonctionnel de la stimulation de la CI. Irving et ses collègues effectué les deux enregistrements d’eABR aiguë et chronique, mais ne montrent des données provenant de la stimulation chronique CI5. Toutefois, le modèle chronique avec un dispositif implantable développé par Irving et Al est techniquement difficile. On ne sait pas encore si la stimulation aiguë de CI, moins difficile et plus rapide, peut atteindre des résultats similaires.

CIs sont utilisés par des personnes ayant une déficience auditive grave et profonde qui ne plus bénéficier d’aides auditives. Des modèles animaux pour les utilisateurs de CI devraient donc inclure une procédure assourdissante lorsqu’il entend normalement d’animaux sont utilisés. Une autre raison d’assourdir les animaux de l’audience, c’est que la stimulation électrique d’un sourd ou cochlée audience produit différentes réponses neuronales4,8,9,10,11, 12. la stimulation électrique d’une cochlée sourde directement active les fibres du nerf auditif et génère une réponse electroneural (α). Elle est caractérisée par des temps de latence courte et une gamme dynamique petite dans la périphérie de8,10. En revanche, la stimulation électrique d’une cochlée audience excite également les cellules de cheveux dans une réponse électrophoniques (β) qui se caractérise par des latences plus longues et plus grande plage dynamique4,11. La réponse électrophoniques est attribuée à excitation normale des fibres nerveuses par des cellules ciliées internes, contraction induite électriquement des cellules ciliées externes et génération d’un voyage wave4. Les réponses Electroneural et électrophoniques également entraînent deux patterns d’activité différents dans le système nerveux central de9. Sato et al enregistré neurones mésencéphale d’un cochon d’Inde CI implanté avant et après l’assourdissant avec néomycine, qui élimine la contribution électrophoniques. Ils ont montré que la pente de la fonction du niveau de taux est plus raide et taux de combustion plus élevée dans la condition de devenus sourde par rapport à la condition d’audience9. Par conséquent, selon la question de recherche a déclaré, il est important d’envisager d’inclure assourdissant électrophoniques séparé et electroneural réponses lors de la stimulation électrique du nerf auditif.

Nous décrivons ici la procédure pour assourdissant aiguë et l’implantation cochléaire d’un tableau de l’électrode dans une souris ainsi que l’enregistrement fonctionnel d’une stimulation électrique intracochlear avec réponse électriquement évoqué auditif du tronc cérébral (eABR).

Protocol

Toutes les procédures ont été effectués selon l’Université de Bâle, en Suisse, des soins des animaux et des lignes directrices. Ils ont été autorisés par l’Office vétérinaire Suisse du Canton de Bâle. Remarque : Les souris C57BL/6 adultes, âgés de 8 à 12 semaines (20 – 30 g de poids), ont été utilisées dans cette étude.L’oreille gauche est utilisé comme l’oreille expérimentale. L’oreille droite sert un contrôle intra-animaux et n’est pas altérée par chirurgie. 1. préopératoires procédures Anesthésier l’animal 30 min avant la chirurgie intra péritonéale (i.p.) injection de kétamine/xylazine (xylazine 16 mg/kg, i.p., kétamine 80 mg/kg, volume injecté à 10 μL/g de poids corporel). Compléter l’anesthésie si nécessaire, si l’on en juge par une pédale positif et la palpébrale réflexe (toe-pincée) et le mouvement des moustaches, avec une faible dose de kétamine (45 mg/kg, i.p., injecté à 10 μL/g de poids corporel). Agents et régimes de dose peuvent être remplacés par des lignes directrices.Notes : en général, l’animal devra une injection chaque 45 à 60 min avec ce régime d’agent et de la dose. Le temps moyen d’incision initiale à fermeture autour des électrodes implantés est typiquement de 1 à 1,5 heures. Recherchez une sédation complète de l’animal, marquée par un rythme de la respiration régulière et l’absence de réflexes d’orteil-pincement. Maintenir ce niveau de l’anesthésie. Maintenir la température du corps de l’animal à 36,6 ° C, avec un coussin chauffant de la boucle fermée. Appliquer la pommade ophtalmique pour éviter la déshydratation de la cornée. Cela supprimera également réflexe de clignement de l’animal, qui peut ajouter du bruit à la reprogrammation. Administrer un analgésique local via une injection sous-cutanée (s.c.) de bupivacaïne/lidocaïne (0,1 mg/mL bupivacaïne et lidocaïne de 0,4 mg/mL, 0,1 mL administrée l.c.) le long de la ligne d’incision prévue afin de minimiser l’inconfort chirurgical. Agents et régimes de dose peuvent être remplacés par des lignes directrices. Administrer de l’atropine antagonistes muscariniques (atropinesulfate aminé, 0,1 mg/mL, 20 μL administré l.c., dissoute dans du PBS) dans le cou pour réduire la sécrétion de mucus et faciliter la respiration. Agents et régimes de dose peuvent être remplacés par des lignes directrices. 2. pré assourdissant acoustique Auditory Brainstem Response (PEAATC) Remarque : PEAATC est utilisé pour mesurer l’état de l’audience avant et après l’assourdissant. Tests sont réalisés sur l’oreille gauche et dans une cabine insonorisée électrique blindée. Nous vous recommandons de tester et implanter plus tard l’oreille gauche pour un droitier. On trouvera des précisions sur ABR chez la souris13,,14. Tucker Davis Technologies (TDT) matériels et logiciels (BioSig) sont utilisés pour enregistrer les ABR mais d’autres systèmes peuvent être utilisés. Bloquer l’oreille controlatérale (à droite) avec une mousse acoustique pour isoler la réponse ABR de l’oreille ipsilatérale (gauche). Mettre la mousse dans une seringue de 1 mL et injecter dans le canal d’oreille droit de la souris pour couvrir le conduit auditif tout avec de la mousse (0,1 à 0,2 mL de mousse). Assurez-vous que les joints seringue étroitement à l’oreille pour que la mousse se fond dans le conduit auditif. Placez l’enceinte 10 cm de l’oreille gauche.Remarque : L’orateur pour cette configuration a été étalonné à l’aide d’un microphone de PCB comme décrit dans refefence15. Nettoyer les électrodes ABR avec la solution d’éthanol à 70 %. Placer les électrodes sous la peau : actif (Ch1) sur le vertex, (-) de référence sous le pavillon de l’oreille ipsilatérale et au sol dans la patte arrière (Figure 1). Connecter la tête-scène et préamplificateur au processeur auditif via le port de la fibre optique. Vérifier l’impédance de l’active et une électrode de référence. Si l’impédance est de plus de 3 ohms, ré-organiser les et re-prendre la mesure. Les meilleurs enregistrements sont obtenus lorsque les électrodes ont la même impédance. Fermer la cabine insonorisée. Présenter la stimulation cliquez et enregistrer ABR dans un état de champ libre avec un logiciel et un processeur sonore complexe. Normaliser le stimulus de clic dans le logiciel : 0,1 ms monocanal monophasique clics sont présentés à 21 Hz ; Cliquez sur niveau passe de 90 dB SPL à 10 dB SPL en incréments de 10 dB ; 10 ms fenêtre d’enregistrement. Un total de 512 réponses à chaque niveau de dB en moyenne. Appliquer un filtre passe-bas 2 000 Hz et un filtre passe-haut 300 Hz en mode hors connexion pour réduire le bruit dans l’enregistrement à l’aide d’un script Matlab sur mesure. Déterminer le seuil ABR comme le niveau le plus bas de la dB avec une réponse de vague ABR reconnaissable (Figure 2, Figure 3). 3. chirurgie Remarque : Instruments typiques utilisées comprennent des ciseaux, scalpel, une paire de pinces métalliques avec bouts droits ou incurvés, un outil de rétracteur de tissu, plusieurs coins d’aspiration et pointes de papier absorbable. La chirurgie est exécutée sur l’oreille gauche. Placez la souris sur son côté droit. Éviter les contraintes de torsion excessive sur les vertèbres cervicales. Veillez à garder le corps directement à garder les voies respiratoires ouvertes. Couper la fourrure derrière l’oreille gauche avec un ciseaux (ou raser avec un rasoir) pour exposer la peau. Stériliser la peau avec la solution d’éthanol à 70 % et de la Bétadine (povidone/iode). Sous grossissement microscopique (x 16), faire une incision de 1 à 1,5 cm après auriculaire avec le scalpel. Basculez vers microscopique grossissement (x 25). Effectuer une dissection émoussée par le biais de la couche de graisse sous-cutanée, qui peut être d’épaisseur variable, avec une pince.Remarque : Faites attention en disséquant comme la veine jugulaire externe parcourt cette région. Dommages à cette structure peuvent causer des saignements excessifs. Rétraction du muscle sternocléidomastoïdien pour révéler le périoste bulla tympanique. Utilisez le nerf facial comme un repère anatomique clé pour faciliter l’identification de la bulle tympanique auditive. Le nerf facial entoure le bord postérieur/dorsal du muscle sternocléidomastoïdien et longe rostralement auditif vers le pavillon. Placez doucement l’outil rétracteur autoblocants dans l’incision pour faciliter l’accès à la bulle tympanique (Figure 4). Retirez le tissu recouvrant la zone medio-dorsale de la bulle tympanique pour permettre une visualisation claire de la crête entre la bulle tympanique et l’apophyse mastoïde. Tourner délicatement une aiguille 30 G pour percer la bulle tympanique et faire un trou (bullostomy) sur la partie postéro-supérieure de la crête (l’os sont plus fine de ce côté). Alternativement, utiliser une fraise chirurgicale dentaire.Remarque : Cela et les étapes suivantes peuvent être faits avec la même grossissement microscopique (x 40) si vous préférez. Si nécessaire, changer la position du microscope. Il est important de maximiser la vue chirurgicale de l’espace de l’oreille moyenne. Élargir le bullostomy en pinçant les morceaux de petits os à l’aide de pinces à pointe fine pour exposer la cavité de l’oreille moyenne. Étendre la bullostomy sur le dos vers l’apophyse mastoïde jusqu’à ce que la niche de la fenêtre ronde est exempte de tout recouvrant les os. L’artère stapédiens, une branche de l’artère carotide interne, court ventrale à la niche de la fenêtre ronde. Veillez à ne pas endommager le navire comme un saignement excessif peut causer la mort. Petits saignements peuvent être arrêtés en appuyant sur un petit morceau de spongostan dans la cavité de l’oreille interne. Étendre la bullostomy vers le sens antérieur supérieur à visualiser l’étrier, l’os de l’oreille moyenne connecté à la fenêtre ovale. Retirer l’étrier avec une pince pour exposer la fenêtre ovale. 4. tour de fenêtre Application d’Agent ototoxique Doucement perforer les membranes de fenêtre et la fenêtre ovale ronds à l’aide d’une aiguille de 30 G émoussés. Vérifiez que périlymphe s’épuise. Lentement perfuse néomycine poids/volume de 0.05 % dissous dans du PBS (ajusté à pH 7,4) à travers la fenêtre ovale. Liquide doit vider hors de la fenêtre ronde. Répétez la même procédure sur la fenêtre ronde. Veillez à ne pas endommager les structures osseuses de la fenêtre avec l’aiguille utilisée pour perfuse. Placer un petit morceau (1 mm2) du spongostan imbibé de néomycine au sein de la niche ronde de fenêtre et la fenêtre ovale. Enlever l’outil de l’enrouleur, refermer l’incision et attendez 30 min. 5. après assourdissant ABR acoustique Enregistrer PEAATC de façon semblable comme auparavant assourdissant (étapes de 2,2 à 2,8) (Figure 2 b, Figure 3). 6. insertion d’électrodes de CI Remarque : Électrodes intracochlaire se compose de quatre bandes de platine (Ø0.2 mm) avec du fil de platine/iridum parylène isolé blindé dans un tube de silicone (Figure 5). Placez l’outil rétracteur dans l’incision pour accéder de nouveau à la bulle tympanique. Insérez les électrodes dans la fenêtre ronde (scala timbales) à une profondeur où la 4ème platine sonnerie est situé à l’intérieur de la fenêtre ronde. Cela donne une profondeur d’insertion de ~ 2 mm, correspondant à un poste d’intracochlaire à ~ 30 kHz16. Enrouler le fil à l’intérieur de la bulle tympanique et coller le fil sur le tissu au-dessus de la bulle tympanique. Enrouler le fil permet de garder le tableau en place tout au long de l’expérience. Retirer le rétracteur soigneusement et fermer l’insertion avec la colle tissu. Faire une petite incision (0,5 mm) dans le cou perpendiculaire à la ligne entre l’endroit où les actifs et les électrodes de référence ABR utiliseront un ciseaux tissu. Placer le ballon au sol platine dans la poche sous-cutanée et fermer la petite incision avec de la colle tissu (Figure 6). Raccorder la carte de tableau d’électrode à la plate-forme de stimulateur d’Animal. 7. electric Auditory Brainstem Response (eABR) Remarque : Une plate-forme de stimulateur Animal (ASP) sert à stimuler électriquement les électrodes. Autres sources de courant et les systèmes de logiciel peuvent être utilisés. Placez les électrodes ABR comme avant (étapes 2.3 à 2.5) (Figure 6). Ouvrez le logiciel ASP et définissent le paradigme de la stimulation d’impulsion électrique. Nous utilisons un impulsions biphasiques équilibré avec 50 μs/phase et 10 μs interphase écart présenté à 23,3 impulsions par seconde (pps). La stimulation électrique est livrée en configuration d’électrodes monopolaires avec l’augmentation des niveaux actuels. Un total de 400 réponses sont en moyenne à chaque niveau actuel. Présenter les trains d’impulsions électriques et d’enregistrer la réponse eABR évoqués en continu via le préamplificateur TDT, processeur préamplificateur et auditif. Tracer et analyser les données d’eABR via un script matlab sur mesure (Figure 7). Le script et un exemple d’un enregistrement sont fournis dans la complémentaire. 8. fin de l’expérience À la fin de l’expérience, euthanasier l’animal selon les lignes directrices. Ouvrir l’incision et retirer l’implant. Ultra-soniquer électrodes dans l’eau distillée pendant 10 min enlever les débris tissulaires.Remarque : L’implant peut être réutilisée plusieurs fois si les électrodes sont intacts et bien tenue. Pour le vérifier, mesurer l’impédance des électrodes avec un multimètre quand le tableau est sec. Ranger les électrodes dans un endroit sec.

Representative Results

Le but de cette étude était de décrire un modèle fiable pour stimulation CI aiguë chez la souris devenues sourde. Seuils d’audibilité pré- et post-opératoire a été une lecture fonctionnelle de la procédure assourdissante. L’application topique de néomycine 0.05 % dans la fenêtre ovale et ronde augmenté significativement les seuils d’audibilité évoquée par clic par 46 dB ± 6 (néomycine après vs pre : 30,0 dB ± 3,8 vs 75,7 dB ± 3,7, p = 0,0003, jumelé t-test, n = 7) (Figure 3). Taille souris électrodes était ci-après inséré dans la fenêtre ronde (Figure 4, Figure 5). Simulation électrique d’une électrode d’intracochlaire pourrait sûrement générer une activité eABR. (Figure 7). Dans certains cas, la stimulation CI activé le nerf facial et produit une onde de grande amplitude avec une latence soit courte ou longue (Figure 8 a et 8 b Figure, respectivement). La réponse courte latence se caractérisait par une amplification rapide d’onde IV autour de 3 ms et est susceptible d’être une réponse directe du nerf facial. La réponse de la longue période de latence est apparu environ 5 à 6 ms et est susceptible d’être une réponse musculaire non auditifs (myogène) évoquée indirectement par le nerf facial. Réponses du nerf facial sont rarement rapportés dans les études chez l’animal dans la littérature, mais sont une complication bien connue à l’humain CI utilisateurs17,18,19. Dans Figure 8, la stimulation du nerf facial est apparu au niveau actuel relativement moyen (150 à 200 μA) et chez les deux animaux différents. Dans d’autres cas, les deux réponses pourraient apparaître dans le même animal à des niveaux très élevés de courants (non illustré). Nous vous recommandons de limiter le niveau actuel à des niveaux inférieurs de l’apparence de la stimulation du nerf facial. Figure 1 : configuration Auditory Brainstem Response (ABR). Sous-cutané électrodes sont placées au sommet (active/canal 1 [Ch1]), derrière l’oreille ipsilatérale (référence [Ref]) et à la patte arrière (sol [Gnd]) de la souris anesthésiée. Signaux de l’électrode sont amplifiés et ensuite enregistrés par un système TDT. Stimulation acoustique et électrique sont présentées via un microphone et une plate-forme de stimulateur Animal, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : PEAATC représentant des ondes pour cliquer sur la stimulation d’une souris sauvage avant et après l’assourdissant avec 0.05 % néomycine. Modèle PEAATC (A) l’audience normale est caractérisé par des ondes portant la mention I-V et un seuil de faible audience, ici 30 dB SPL (flèche). (B) le PEAATC sourde montre un seuil d’audition accrue, ici 70 dB SPL (flèche). Les vagues ont une plus longue période de latence et gigue temporelle plus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : seuil de PEAATC avant et après l’assourdissant. Application de néomycine significativement augmenté les seuils de PEAATC 46 dB ± 6. Néomycine après vs pre : 30,0 dB ± 3,8 vs 75,7 dB ± 3,7, p = 0,0003, jumelé t-test, n = 7. Les erreurs sont écart-type des moyens. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : la chirurgie. (A) l’exposition à la bulle tympanique auditive. Le bullostomy est effectué (cercle en pointillés blanc) le long de la crête sur la bulla tympanique (pointillé noir). (B), le bullostomy permet la visualisation de la fenêtre ronde, artère stapédiens et fenêtre ovale. Néomycine est délicatement rincer d’abord la fenêtre ovale, puis la fenêtre ronde. Tableau (C), l’électrode est insérée jusqu’à ce que l’électrode deth 4 est situé à l’intérieur de la niche de la fenêtre ronde. Le fil est enroulé à l’intérieur de la bulle tympanique pour garder le tableau en place avant la fermeture de l’incision. CN VII = nerf crânien VII (nerf facial), oe = fenêtre ovale, RW = fenêtre ronde, SA = artère stapédiens, SCM = muscle sternocléidomastoïdien, TB = bulla tympanique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : l’implant cochléaire souris. (A) les électrodes d’intracochlaire se compose de quatre bandes platine espacées à un intervalle de 0. 4 mm avec un diamètre d: 0 [astuce] (d = 0,21), 1 (d = 0,23), 2 (d = 0,25), 3 (d = 0,27). La largeur de chaque électrode est de 0,2 mm. Les quatre fils de platine/iridium (90/10) parylène isolé sont protégés dans un tube de silicone. Grossissement (B) de l’électrode de tableau (carré en pointillés rouge). Électrodes et une boule de la platine de référence sont connectés à une carte imprimée. Echelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : installation électrique évoquée par ABR (eABR). La boule de terre CI platine (Gnd, rouge) est placée dans une poche sous-cutanée dans le cou de la souris. La ligne entre les actifs (Ch1(+) au sommet) et les électrodes de référence (Ref (-) l’oreille ipsilatérale) ABR est perpendiculaire à la ligne entre les électrodes et le sol afin d’obtenir la meilleure réponse eABR. L’électrode de terre eABR (Gnd, noir) est placé dans la patte arrière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 7 : eABR représentant les vagues à la stimulation de la CI chez une souris sourde. Un train d’impulsions biphasiques est décerné à électrode #1 en configuration monopolaire à 23,3 impulsions par seconde (pps) avec 400 répétitions. Des stimuli niveau 0-175 μA apparaît en 25 étapes μA (voir les détails de la stimulation au point 7.2 de l’étape). Chiffres romains indiquent le nombre d’onde eABR. L’amplitude de l’onde et la latence augmentent et diminuent, respectivement, avec une augmentation de niveau actuel. Dans cet exemple, le wave II est apparu environ 1 ms, wave III environ 2 ms, vague IV autour de 3 ms,, onde V environ 4 ms. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 8 : exemple de la stimulation du nerf facial. Dans certains cas, la stimulation CI peut activer le nerf facial et évoquent une réponse directe avec courte latence (A) (flèche) ou indirecte avec une latence plus longue (B) (flèche). Les exemples présentés proviennent de deux animaux CI-implanté stimulés avec un train d’impulsions biphasiques à l’aide de 0 – 300 μA en μA 50 étapes (voir les détails de la stimulation au point 7.2 de l’étape). Chiffres romains correspondent aux nombres d’ondes eABR. * dénote le détourage de la vague d’eABR en raison de la saturation de l’amplificateur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce manuscrit décrit l’approche chirurgicale pour assourdissant aiguë et de l’implantation cochléaire chez la souris, ainsi que l’évaluation fonctionnelle de la stimulation de la CI avec réponse auditif du tronc cérébral. Bien que la cochlée souris est petite et la chirurgie difficile, le modèle de souris de CI est réalisable et constitue un outil précieux dans la recherche sonore.

L’artère stapédiens est présent dans l’oreille de la souris. L’artère entre la bulle tympanique postéro-médiale et s’abaisse à la niche de la fenêtre ronde, puis mêle à la niche de la fenêtre ovale. Dans le développement initial du modèle souris, nous avons connu fatal peropératoire saignement suivant un traumatisme de l’artère stapédiens, principalement lors de l’accès la bulle tympanique. En conséquence, nous adaptés à une approche plus limitée et consulté la bulle tympanique dans les étapes de la dissection plus petits, raffiné. Aucune complication supplémentaire en raison de saignements ont été observées par la suite. Malgré le fait que cette cautérisation stapédiens artère n’a aucun effet significatif du seuil d’audition ou du nombre de neurones du ganglion spiral souris5, à notre avis, il n’est pas nécessaire tant que l’attention et soin sont prises au cours de la chirurgie. Nous vous suggérons de prendre le temps nécessaire pour développer les aptitudes psychomotrices fines et atteindre la compétence technique. La durée moyenne de l’incision initiale à fermeture autour d’électrodes implantées est généralement 1 – 1,5 h.

La chirurgie de CI aiguë décrite chez la souris est similaire à la procédure « ventrale » et l’insertion de fenêtre ronde utilisée chez les autres rongeurs, y compris des rats et des gerbilles20,21,22. Autres études sur les rongeurs ont utilisé l’approche « dorsale » avec un cochleostomy tour basal au lieu d’une insertion de la fenêtre ronde, évitant la SA entièrement et en insérant le tableau plus profondément6,23,24. L’implantation d’une assemblée d’une stimulation chronique chez la souris suit les mêmes étapes comme décrit dans le présent protocole avec l’ajout d’un maillage de Dacron pour fixer l’implant et les soins postopératoires5.

Les principaux défis techniques lors de l’exécution des chirurgies de la CI chez les souris sont la petite taille de la cochlée par rapport à la cochlée des rats et des gerbilles et la présence d’un grand as. La SA est également présente chez les rats, mais pas pour gerbilles. En outre, étant donné que les souris sont plus petits que les rats et les gerbilles, elles sont plus vulnérables aux interventions chirurgicales.

Pour éliminer les réponses électrophoniques eABR enregistrements et pour imiter la perte de cellules de cheveux trouvée dans la plupart des utilisateurs de CI, nous avons assourdi les animaux avant l’insertion de la CI. Souris sont difficiles à assourdir ototoxically in vivo25 car les concentrations systémiques d’aminosides requis pour provoquer l’ototoxicité dispose d’une fenêtre étroite dose : plus faibles doses donnés plusieurs résultats jours aucune perte des cellules ciliées, alors qu’une seule injection d’une dose plus élevée peut être létale26. Sensibilité aux aminosides est également dépendante de la souche26. Toutefois, il a été démontré qu’une dose unique d’aminosides en association avec un diurétique de boucle peut produire perte excessive les cellules ciliées externes chez des souris CBA/CaJ sans conséquences fatales27. Mort cellulaire retardée de cheveux interne a été signalée dans la moitié de tous les limaçon examiné27.

Dans ce manuscrit, nous avons utilisé l’application topique de la néomycine aminoglycosides inspiré par le protocole récemment mis en place pour de souris C57BL/65. Application aiguë de néomycine significativement augmenté le seuil d’audience évoquée par clic 46 dB ± 6,1. Bien que cette augmentation est plus importante que l’augmentation de 35 dB rapportée par Irving et al. (après la chirurgie avant vs : 41,6 dB ± 3,3 vs 76,6 dB ± 4.4, p = 0,02, n = 3) 5, nous avons atteint le seuil même après assourdissant (75,7 dB ± 3,7 vs 76,6 dB ± 4.4). 0.05 % néomycine est pensé pour provoquer une perte partielle d’audition, principalement par la mort rapide les cellules ciliées externes, comme la perte des cellules ciliées internes prend plus de temps pour se produire27. Il est donc possible cette réponse électrophoniques, qui est générée en interne et les cellules ciliées externes4,8,9,10,11,12, n’est partiellement éliminées chez les animaux devenus sourds avec audition résiduelle. Bien que 0,05 % (poids/volume) néomycine ne diminue pas le nombre de neurones du ganglion spiral 4 semaines post-assourdissant5, c’est encore inconnu si néomycine dans notre installation aiguë affecte les fibres du nerf auditif ou favorise la synaptopathy (perte des synapses entre les cellules ciliées internes et type j’ai auditif nerveuses fibres). Une autre incertitude est que le traitement de la néomycine topiques peut-être ne pas produire une distribution uniforme de la perte des cellules ciliées le long de la cochlée. Futures études sont nécessaires pour répondre à ces questions.

En résumé, le nombre croissant de modèles génétiques pour surdité humaine et les outils biochimiques disponibles font à la souris un modèle animal attrayant pour la recherche auditive, y compris le domaine de la CEI.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiens à remercier Pierre Stahl, Oticon médical, Nice (France), pour fournir des plateforme de Stimulation des animaux et des conseils sur les paradigmes de la stimulation et James B. Fallon et Andrew K. Wise bionique Institute, Melbourne (Australie), pour obtenir des conseils chirurgicaux . Ce travail a été soutenu par une subvention de la Swiss National Science Foundation (subvention du transfert cer à C.R.I.).

Materials

Hardware
Sound-proof booth IAC Acoustics, Winchester, UK Mac-2 Enclosure RF Shielded Box 2A
MF1 Speaker Tucker Davis Technologies (TDT), FL, USA
PCB microphone PCB Piezotronics, Inc, NY, USA Model 378C01
Low impedance headstage TDT, FL, USA RA4LI
Medusa pre-amplifier TDT, FL, USA RA4PA
RZ6 auditory processor TDT, FL, USA
Animal Stimulator Platform ASP, Oticon Medical, Nice, France
Multimeter Fluks #115
Surgical equipment
Closed-loop heating pad FHC, Inc. ME, USA
Eye ointment Alcon, CH Lacrinorm Augengel
Acoustic foam Otoform Ak, Dreve Otoplastik GmbH #464
Disposable subdermal needle electrodes Horizon, Rochester Electro-Medical Inc. S83018-R9, 27G
Self-retaining retractor tool (Mini Collibri Retractor) Fine Science Tools #17000-01
Suction wedges Agnthos, SE #42-886-460
Absorbable paper point (Medium) WPI, FL, USA #504182
Intracochlear electrode array Bionics Institute, Melbourne, Australia 4 channel
Spongostan Standard Ferrosan Medical Devices #MS0002
Tissue glue. Loctite 4161 Superbond Henkel Part No 19743
Animal Stimulator Platform (ASP) Oticon Medical, Nice, France
Drugs/chemicals
Ketamine (Narketan) Provet AG, CH 100mg/mL, #VQ_320265
Xylazine (Rompun) Provet AG, CH Inj Diss 2%, # 1315
Bupivacaine Compendium, CH Bupivacain Sintetica inj Diss 0.5%
Atropine (Atropinesulfat Amino) Amino AG, CH 1 mg/ml
Betadine (Povidone/iodine) Provedic, CH
Neomycin (Neomycin trisulfate salt) Sigma N1876-25G, Lot#WXBB7516V
Software
BioSigRZ TDT, FL, USA
Matlab MathWorks, MA, USA
ASP software Oticon Medical, Nice, France
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Referências

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Navntoft, C. A., Marozeau, J., Barkat, T. R. Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (143), e58073, doi:10.3791/58073 (2019).
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