Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem
Summary
Burada bir uyarlanabilir, tüm ana bilgisayar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma ve ilaç keşfi için kullanılması için kullanılması gereken yüksek içerik tarama aracı bir protokol açıklayın.
Abstract
Belirlenen yeni uyuşturucular sayısı tarafından geleneksel, vitro ekranları kaybeder, bu yaklaşım başarı çoklu ilaç direnci mücadele etmek yeni bir silah için arama azaltmak. Bu araştırmacılar sadece yeni ilaçlar bulmak gerekir mi ama aynı zamanda onları bulmak için yeni yollar geliştirmek zorundayız sonuca neden olmuştur. Arasında en umut verici aday yöntemleri bütün organizma, vivo içinde bu kullanım yüksek üretilen iş, fenotipik dökümanları deneyleri ve Caenorhabditis elegans arasında değişen Danio rerioiçin ev sahipliği yaptı. Bu ana bilgisayarlar ana bilgisayar ve/veya biounavailable toksik bileşikler genellikle ilk ekranında, pahalı takip önce yukarıya bırakılır dramatik indirimleri yanlış pozitif hits içinde dahil olmak üzere birkaç güçlü avantajlara sahip.
İşte nasıl bizim tahlil iyi belgelenmiş C. elegansana bilgisayar varyasyon sorguya çekmek için kullanılan göstermektedir —Pseudomonas aeruginosa sıvı öldürme pathosystem. Biz de dışarı iyi çalışan bu tekniğin çeşitli uzantıları göstermek. Örneğin, plaka biçimleri sorgu ana faktörler bu konak-patojen etkileşim içinde yüksek-den geçerek genetik ekranlar RNAi 24 – veya 96-da kullanarak gerçekleştirmek edebiliyoruz. Bu tahlil kullanarak, tüm genom ekranlar dramatik potansiyel ezelî belgili tanımlık lüzum için zahmetli biyokimyasal arıtma yaklaşımlar uyuşturucu hedefler belirleme görevini basitleştirebilirsiniz sadece birkaç ay içinde tamamlanabilir.
Biz de gram-pozitif bakteri Enterococcus faecalistir Ayagin Gram-negatif patojen P. aeruginosaiçin yerine koyar bizim Yöntem bir varyasyon rapor. Çok P. aeruginosaiçin olduğu gibi E. faecalistir öldürerek zamana bağımlı. Aksine önceki C. elegans—E. faecalistir deneyleri, bizim tahlil E. faecalistir preinfection gerektirmez, onun Emanet profil iyileştirilmesi ve sıvı işleme aygıtları kirletici şansını azaltır. Tahlil ~ %95 ölüm oranları 96 h sonrası enfeksiyon gösterilen son derece sağlamdır.
Introduction
Şimdi neredeyse bir yüzyıl önce liderliğindeki bir dönüm noktası an kamu sağlığı için kimlik ve etkili, geniş spektrumlu antibiyotikler, yaygın inanç bu bulaşıcı olduğu yere hastalığı belası geçmiş olurdu. Kısa birkaç on yıl içinde bu iyimserlik, küçülmek patojen bu bir kez mucizevi tedaviler sınırlı direnç mekanizmaları geliştirilen sonra patojen başladı. Bir süre için ilaç bulma çabaları ve patojenler arasındaki silahlanma yarışı dengeli görünüyordu. Ancak, antimicrobials suistimal son zamanlarda Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensve P. aeruginosa1pan-ilaca dirençli suşların ortaya çıkması içinde sonuçlandı, 2,3,4.
P. aeruginosa ciddi yanıklar, immün veya kistik fibrozis var olan hastalar için ciddi bir tehdit olan bir fırsatçı, gram negatif, birden çok ana bilgisayar patojen var. Bu da giderek şiddetli Nozokomiyal Enfeksiyonlar, özellikle antimikrobiyal direnç www.cdc.gov/devam eden onun edinimi nedeniyle bir etken olarak tanımlanmaktadır. Bu tehdide yönelik olarak başlamak için iyi belgelenmiş C. elegans–P. aeruginosa enfeksiyon sistem5kullandık. Laboratuarımızın ana bilgisayar6öldürmek için yetenek patojenin sınırlamak roman bileşikler tanımlamak için bir sıvı tabanlı, yüksek üretilen iş, yüksek-içerik filtreleme platform geliştirmek için bu sistemi kaldıraçlı. Çoğu intriguingly konularda, bu bileşiklerin antimicrobials7 ve virülans inhibitörleri8de dahil olmak üzere en az üç genel kategoride için ait gibi görünüyor. C. elegans diğer yüksek içerikli ilaç keşif deneyleri bildirilmiştir Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria Monositogenez, FRANCISELLA tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, için ve Enterococcus faecalistir, diğerleri arasında9,10,11,12,13,14,15,16. Bu tür deneyleri hem ev sahibi ve patojen, kimyasal bir ekran ve sayısı ötesinde tanımlama yeteneği ile karşılaştırıldığında bioavailability olasılığı arttı toksik olabilir yanlış pozitif sayısı sınırlama gibi birkaç iyi tanınan avantajlara sahip Sadece sınırlayıcı mikrobiyal büyüme, anti-virulents, bağışıklık uyarıcı molekülleri veya aksi takdirde lehine eski ev sahibi-patojen etkileşimin denge tilt bileşikleri gibi. Ayrıca, bu ekranlar keşfetti bileşikler kez memeli konaklarda etkilidir.
En az iki başka deneyleri17,18 C. elegans yüksek üretilen iş ekranları sıvı içinde yürütmek kullanılabilir fazlalaştı. Ancak, bu deneyleri herbiri sıvı içinde gerçekleştirilecek yavaş-öldürme olarak, bilinen prototip kolonizasyon bağırsak tahlil sağlar bir değişiklik olduğunu üretilen işi artırmak ve bileşikleri daha kolay taranması izin. Dikkatli karakterizasyonu kesin bakteriyel virülans mekanizmalarının bu deneyleri ve bizim sıvı tabanlı ekran7arasında farklı olduğunu göstermiştir. Bu yana virülans her iki tür memeli sistemlerinde gözlenir, hangi virülans belirleyici tahlil seçim öncesinde deneyci’nın çıkarları için en uygun dikkate almak önemlidir.
Burada biz sıvı tabanlı en iyi duruma getirilmiş bir sürümünü göstermek C. elegans-P. aeruginosa tahlil. Biz de gram-pozitif bakteri patojen karşılamak için bizim sıvı tabanlı tahlil yöntemi uyarlaması rapor Enterococcus faecalistir. P. aeruginosagibi E. faecalistir giderek antimikrobiyal direnç yolları1büyüyen bir silah ile bir ciddi nozokomiyal tehdit olarak tanımlanır. E. faecalistir ile yüksek-den geçerek taranması için önceki bir yöntemi14bulunmaktadır ancak preinfection yordamı olmak zordur ve ekipman COPAS FlowSort gibi bulaşıcı olasılığını artırır patojen ile gerektirir. Bizim protokol güvenlik profili artırma yükleyemeyebileceğini gereksinimini ortadan kaldırır. Son olarak, biz hangi tarafından bu deneyleri birini RNAi, kurulması, içinde bir rol ana faktörleri için Kullanıcı aramak için izin veya direnç, enfeksiyon besleme ile kombine edilebilir bir araç raporu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu tahlil (veya benzer deneyleri P. aeruginosa veya E. faecalistiriçin diğer patojenleri nerede yerine) amaçlı ilaç keşfi de dahil olmak üzere, çeşitli için yararlı olur. Virülans faktörleri, konak savunma yolları, aydınlatma belirlenmesi ve düzenleyici makine ana bilgisayar-patojen etkileşimde yer alan ilgili belirleme gibi temel biyolojik soru ele almak için yararlıdır.
P. aeruginosa sıvı öldürme tahlil sağlam olsa da, nerede dikkat başar?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada kanser önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü (CPRIT) ödül RR150044, Welch Vakfı araştırma hibe C-1930 ve ulusal kurumları, sağlık K22 NVK için layık AI110552 tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Large object flow cytometer/worm sorter | |
| Cytation 5 | BioTek | ||
| EL406 Washer Dispenser | BioTek | ||
| Multitron Pro | Infors HT | ||
| 24 Deep-Well RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-Well plate | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
| Nematode Growth Media (NGM) | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) plates | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) media | Amount per liter: 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Lysogeny Broth (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
| Brian Heart Infusion broth (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
| Worm Bleach Solution | Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water | ||
| S Basal | Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water | ||
| Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
| NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
| Peptone | USBiological Life Sciences | P3300 | |
| CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Phospate buffer | amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M) | ||
| KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
| 5% Sodium Hypochlorite Solution | BICCA | 7495.5-32 | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Breathe-easy | Diversified Biotech | BEM-1 | |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Fisher Scientific | S11368 | |
| Bacterial Strains | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| E. faecalis(OG1RF) | |||
| E. coli superfood (OP50) | |||
| E. coli RNAi expressing bacteria (HT115) | |||
| Worm Strains | |||
| glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) | |||
| PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |
Referências
- Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
- Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
- Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
- Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
- Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
- Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
- Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
- Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
- Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
- Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
- Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167 (2013).
- Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
- Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
- Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
- Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).
- Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).
- Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).
- Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
- Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
- Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
- Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).
- Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
- Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
- Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).
