Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Benjam&#237; Oller-Salvia

doi:10.3791/58066

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Química

Codifica genetica di un aminoacido Non-canonica per la generazione di anticorpo-farmaco coniugati attraverso una reazione di Bioorthogonal veloce

Published: September 14, 2018

doi:

10.3791/58066

Benjamí Oller-Salvia¹

¹Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology

Summary

Che incorporano un derivato del ciclopropene di lisina in anticorpi permette il collegamento di site-specific, rapido ed efficiente delle molecole tetrazine-cuscinetto per generare i coniugati di anticorpo-farmaco.

Abstract

Coniugati di anticorpo-farmaco (ADCs) utilizzati al giorno d’oggi nella pratica clinica sono miscele di molecole di anticorpo collegate a un numero variabile di tossine in posizioni diverse. Studi preclinici hanno dimostrato che l’indice terapeutico di questi tradizionali ADC può essere migliorata dal collegamento site-specific di tossine. Tuttavia, approcci attuali per produrre omogeneo ADCs presentano alcune limitazioni, come espressione della proteina bassa e lenta reazione cinetica. In questo protocollo descriviamo come impostare un sistema di espressione di incorporare un Ciclopropene derivato della lisina (CypK) anticorpi usando espansione codice genetico. Questo handle bioorthogonal minimal permette rapida coniugazione di tetrazine derivati attraverso una cicloaddizione di Diels-Alder inversa-domanda. Il sistema di espressione qui segnalato consente la facile produzione e purificazione di trastuzumab cuscinetto CypK in ciascuna delle catene pesanti. Spieghiamo come collegare l’anticorpo per la tossina monometil auristatin E e caratterizzano il immunoconjugate di interazione idrofobica cromatografia e spettrometria di massa. Infine, descriviamo le analisi per valutare la stabilità nel siero umano del collegamento dihydropyridazine derivanti dalla coniugazione e testare la citotossicità selettiva di ADC per cellule di cancro al seno con gli alti livelli del recettore HER2.

Introduction

Coniugati di anticorpo-farmaco (ADCs) combinano la selettività di biotherapeutics e la potenza di piccole molecole citotossiche. La maggior parte ADC mirano a diminuire gli effetti collaterali della chemioterapia tradizionale di farmaci che influenzano la polimerizzazione del DNA o dei microtubuli a cancro cellule¹. Prima generazione ADCs approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) si basano sulla modifica delle lisine e cisteine, che genera miscele di molecole per volta alle diverse posizioni con proprietà farmacocinetiche in diminuzione². Al contrario, site-specific coniugazione di farmaci per gli anticorpi può generare composti con indici terapeutici migliorata³^,⁴. Cercando di affrontare la sfida di produrre ADCs omogeneo, diverse modifiche di chimiche ed enzimatiche selettive sono stati segnalati¹^,⁵. Tuttavia, gli attuali metodi possono solo certa posizione dell’anticorpo di destinazione, soffrono di espressione della proteina bassa, fornire linker con bassa stabilità o si basano sulle reazioni lente e basso rendimento.

Incorporazione di aminoacidi non canonico (ncAA) attraverso l’espansione del codice genetico permette l’installazione site-specific di una pletora di gruppi reattivi bioorthogonal nelle proteine, potenzialmente superare le limitazioni di altri metodi utilizzati per generare ADC. Codifica ncAAs in risposta ad un codone di destinazione (fermata) si basa su coppie di sintetasi/tRNA di aminoacyl-tRNA che sono ortogonali alle coppie endogene che incorporano amminoacidi canonico⁶. Diversi ncAAs sono state integrate di anticorpi per generare ADCs. Tuttavia, più soffrono varie passività per applicazioni nella coniugazione di farmaci terapeutici. p-acetylphenylalanine (pAcF)⁷^,⁸ non è completamente bioorthogonal, richiede basso pH (4.5) e tempi di reazione lunghi (> 60 h), mentre azidi ad esempio p-azidophenylalanine (pAzF)⁷^,⁹^,¹⁰, p-azidomethylphenylalanine (pAMF)¹¹e un derivato di azoturo di lisina (AzK)¹²^,¹³ può essere ridotta nella cella¹⁴, e il rame utilizzato per catalizzare Huisgen CICLOADDIZIONI può indurre il danno ossidativo ¹⁵.

Anche se ncAAs alternativo basato su trans-ciclottene (TCO), cyclooctyne (SCO) e biciclo [6.1.0] none (BCN) recentemente sono state codificate in un anticorpo per scopi di bio-imaging, il sistema di espressione soffre con rese molto basse (0,5 mg/L)¹⁶. Inoltre, cyclooctenes e cyclooctynes sono grandi e maniglie idrofobiche che possono aumentare la suscettibilità di ADC per carichi utili di aggregazione -ADC sono tradizionalmente idrofobiche e le proprietà fisico-chimiche del linker sono state indicate per notevolmente impatto farmacocinetica e indice terapeutico¹⁷. Al contrario, 1,3-disubstitued cyclopropenes sono piccoli gruppi reattivi che dovrebbero causare alterazione minima nella proteina struttura e physichochemical proprietà¹⁸. Cyclopropenes selettivamente e rapidamente reagire con tetrazine tramite una cicloaddizione di Diels-Alder inversa elettrone-domanda¹⁹. In questo protocollo facciamo uso di un derivato del cuscinetto di lisina (CypK, Figura 1b) un metile-Ciclopropene che è meno influenzato dalla sterico di cicli insaturi sforzate più grande e ha una costante di velocità di reazione nell’ordine di 1-30 M^-1s^-1 in mezzi acquosi¹⁸^,²⁰.

Recentemente abbiamo riferito come incorporare CypK anticorpi per generare ADCs facendo reagire questo handle bioorthogonal minimal con molecole tetrazine-cuscinetto²¹. Qui descriviamo la procedura di preparazione di ADC in modo più dettagliato con l’accento sui passaggi più impegnativi. L’incorporazione di CypK è diretto utilizzando una pyrrolysyl-tRNA-sintetasi (PylRS) / coppia di tRNA_CUA(PylT) in risposta ad un codone ambrato introdotto nella catena pesante dell’anticorpo (HC)²². Qui usiamo due plasmidi per trasfezione transiente (Figura 1a), una codifica della catena pesante dell’anticorpo e l’altra codifica la catena leggera (LC), entrambi contenenti la cassetta di PylRS/PylT. In alternativa, una linea cellulare stabile che consente rendimenti più elevati dell’anticorpo può essere generata attraverso un procedimento più laborioso²¹.

I sistemi di espressione di cui sopra in grado di produrre l’immunoglobulina anti-HER2 terapeutico 1 (IgG1) trastuzumab con CypK a livelli simili all’anticorpo di tipo selvaggio. Abbiamo scelto la prima posizione del dominio CH1 sulla catena pesante per codificare la ncAA (HC-118TAG). Questo è il sito più comunemente modificato in ADC²³ ed è conosciuto come HC-118 (EU numerazione) ma inoltre è stato indicato come HC-121 (posizione di sequenza) e HC-114 (numerazione di Kabat)²⁴. Dato che questa posizione è conservata in tutta IgG1s tutti, questi sistemi di espressione dovrebbero essere suscettibili di anticorpi più terapeutici.

Mostriamo che trastuzumab(CypK)₂ può essere facilmente purificato dalla proteina A seguita da cromatografia liquida a proteine veloci con una colonna di interazione idrofobica (HIC-FPLC). Successivamente l’anticorpo è legato covalentemente all’interno di 3 h per il microtubulo polimerizzazione inibitore monometil auristatin E (MMAE), che è usato nel Adcetris di ADC approvato dalla FDA. Qui usiamo un derivato benzilico-tetrazine di MMAE (tetrazine-vcMMAE) con un linker che comprende un distanziatore glutarato e un componente di proteasi-labile di valina-citrullina seguita da un’unità self-immolative p– aminobenzylalcohol; Questo linker viene scisso dalla catepsina B nel lisosoma all’interiorizzazione di ADC conseguente rilascio della tossina²⁵traceless. Al fine di mostrare l’ampia portata della reazione, l’anticorpo è legato anche al fluoroforo tetrametilrodamina (TAMRA). Vi spieghiamo come per verificare l’identità del coniugato di cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) e per calcolare il rapporto di droga–anticorpo (DAR) mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni con una colonna di interazione idrofobica (HIC-HPLC) .

Come parte della caratterizzazione delle prestazioni dell’anticorpo, descriviamo come testare la stabilità del collegamento dihydropyridazine nel siero umano. Questo parametro è più facilmente valutato a trastuzumab-TAMRA perché possono essere quantificato da una semplice ELISA e l’interpretazione dei risultati non è complicata dal componente labile della proteasi di trastuzumab(MMAE)₂. Infine, la selettività e la potenza di trastuzumab(MMAE)₂ viene valutata confrontando la citotossicita di ADC attraverso linee cellulari che esprimono diversi livelli di HER2. Questo test fornisce anche una prova funzionale della stabilità ADC quando eseguita dopo incubazione il immunoconjugate nel siero umano.

Protocol

1. produrre e caratterizzare l’anticorpo Esprimere l’anticorpo Scongelare una fiala di cellule HEK in sospensione in un pallone da 250 mL contenente 50 mL di mezzo di espressione completato con 100 unità/mL penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina e 250 ng/mL anfotericina B. Keep umidificare le cellule a 37 ° C con 8% CO2 in incubatrici dotate di con un agitatore a 125 giri/min. Dividere le celle di 0.3-0.5 x 106 cellule/mL (ogni 2-3 giorni) almeno 2 volte prima di trasfezione. Quando una densità pari a 2,5 x 106 cellule/mL è raggiunti (2-3 giorni dopo lo Split), preparare una soluzione fresca di 100 mM CypK. Per questo scopo, è necessario pesare 64 mg di CypK, aggiungere 2,5 mL di 0,1 idrossido di sodio, vortice, spin giù a recuperare particelle indisciolte tutto e Sonicare. Aggiungere 2,5 mL di CypK (100 mM in 0.1 M NaOH) 42,5 mL di medium di espressione completate con gli antibiotici. Mescolare bene, aggiungere 250 µ l di 0.1 M HCl e sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Diluire 50 µ g di HC e LC pKym1 plasmidi21 a 2,5 mL con il mezzo di riduttore del siero. In un tubo separato, diluire 135 µ l di reagente di transfezione da 2,5 mL con il mezzo di riduttore del siero. Cinque minuti dopo la preparazione delle soluzioni, mescolare i plasmidi e la soluzione di reagente di transfezione e incubare per 20 minuti consentire la formazione di complessi tra il DNA e il reagente di transfezione. Nel frattempo, centrifugare le cellule 125 milioni alla densità di destinazione per 5 min a 500 x g, risospendere con il mezzo di espressione contenente CypK e aggiungere la miscela di reagente di transfezione del DNA –. CypK possono essere acquistati o sintetizzato come riferito precedentemente18. Dopo incubazione le cellule per 20 h, aggiungere 250 µ l di esaltatori di reagente di transfezione incluso nel kit. Raccogliere gli anticorpi dai surnatante 6-7 giorni dopo l’aggiunta del CypK (nessun cambiamento di mezzo è necessario durante l’espressione).* In alternativa, per ottenere rendimenti più elevati e più coerenti, può essere generata una linea cellulare stabile come descritto in Oller-Salvia et al. 201821. In questo caso, trastuzumab(CypK)2 è espresso semplicemente tramite l’aggiunta di CypK 5 mM nel mezzo di espressione. Purificare l’anticorpo Centrifugare le cellule per 15 min a 3000 x g. Filtrare il surnatante con una 0.45 o un filtro da 0,22 µm. Se il filtro diventa occluso, sostituirlo per uno nuovo e continuare a filtrare. Se questo accade dopo solo pochi millilitri, centrifugare il surnatante per altri 15 minuti a 7000 x g. Aggiungere resina di proteina A (2 mL/100 mL di surnatante) in una colonna cromatografia in polipropilene vuota ed equilibrare la resina con almeno 5 volumi di tampone di lavaggio della perla (fosfato di sodio 0,1 M, 150 mM NaCl). Dividere il supernatante in due provette coniche da 50 mL e aggiungere 5 x il tampone di lavaggio di tallone (fosfato di sodio di 0,5 M, 150 mM NaCl) seguita dalla resina A proteina pre-equilibrato. Posizionare il tubo conico su un rullo per 3 h a temperatura ambiente per tirare giù l’anticorpo nel surnatante.In alternativa: Aggiungere il surnatante sulla colonna con almeno il doppio del volume consigliato di resina e permettono di fluire attraverso. Assicurarsi che non ci sia una notevole quantità di anticorpo sinistra nel surnatante da SDS-PAGE. Se c’è, eluire il surnatante attraverso la resina ancora una volta. Trasferire proteina A resina con il surnatante in una colonna e permettere al liquido di fluire attraverso. Aggiungere 25 mL di tampone di lavaggio (o volumi di resina almeno 10) e permettono di fluire attraverso. Eluire l’anticorpo con 4 mL di citrato di sodio 0,1 M, pH 3, su 1 mL di tampone fosfato di 1 M, 150 mM NaCl. Diluire l’anticorpo con 10 mL di PBS, concentrato a 0,5-1 mL di filtraggio centrifugo e buffer di scambio tre volte con PBS. Purificare i campioni di FPLC utilizzando una colonna HIC butile con un flusso di 0,5 mL/min e un 0-100% di pendenza in 30 min di tampone a basso contenuto di sale (50 mM sodio fosfato pH 7.0, 20% isopropanolo) nel buffer del alto-sale (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM sodio fosfato pH 7.0 5% isopropanolo). Raccogliere tutte le frazioni e monitorare l’eluizione a 280 nm. Piccole quantità (< 1 mg) può essere purificato con HPLC-HIC nelle condizioni descritte al punto 2.4 per massimizzare resa e purezza. Piscina le frazioni che contengono anticorpi, diluirli con almeno 4 ml con PBS, concentrano dal buffer centrifughi di filtrazione e cambio tre volte con PBS. Quantificare l’anticorpo Ottenere una concentrazione approssimativa di misurare l’assorbanza a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro del micro-volume. Se una misurazione accurata è necessaria, utilizzare un kit ELISA per misurare IgG umane. Per una stima approssimativa, utilizzare SDS-PAGE con una macchia di Coomassie-base come segue: Preparare gli standard diluendo sei volte due volte un trastuzumab standard quantificati da ELISA a 1 mg/mL. Lessare gli standard e i campioni a circa 0,25 mg/mL nella riduzione il buffer di caricamento. Eseguirli in un Bis-Tris SDS-PAGE 4-12% tramite buffer MES-SDS e macchia con un colorante Coomassie-basato. Infine misurare la densità del colore della banda corrispondente la luce o la pesante catena usando ImageJ e interpolare il segnale dai campioni nella curva standard. Memorizzare l’anticorpo a 4 ° C. 2. l’anticorpo coniugato e caratterizzare l’ADC Coniugare l’anticorpo con la molecola di tetrazine-cuscinetto Diluire 10 molari equivalenti di tetrazine-vcMMAE (4 µ l, 3,4 mM di solfossido dimetilico (DMSO)) con 20 µ l di acetonitrile e 76 µ l di PBS in un piccolo tubo conico (ad es.,provetta PCR). Aggiungere 1 molare equivalente di trastuzumab(CypK)2 (100 µ l, 2 mg/mL in PBS), mescolare accuratamente e lasciare per agire per 3 ore a temperatura ambiente (25 ° C) per formare trastuzumab(MMAE)2.Nota: Altre molecole quali tetrazine-5-TAMRA possono essere collegati all’anticorpo invece tetrazine-vcMMAE usando questo protocollo. Purificare l’ADC Pre-equilibrare una colonna di dimensioni esclusione centrifuga con PBS seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere tutto il volume della reazione sulla colonna di spin e centrifugare a 1500 x g per 1 min. ADC di quantificare e analizzare il coniugato da SDS-PAGE Quantificare l’ADC come descritto in 1.3.2. misurando la densità del colore della catena luminosa su una SDS-PAGE usando l’anticorpo non modificato per la curva standard. La catena pesante dovrebbe avere leggermente spostato mostrando un aumento nel peso molecolare sulla coniugazione.Nota: Se l’anticorpo viene modificata con un fluoroforo come in trastuzumab(TAMRA)2, solo la banda corrispondente alla catena pesante dovrebbe mostrare fluorescenza in gel prima della colorazione. Analizzare il coniugato da HPLC-HIC Equilibrare la colonna HPLC-HIC con tampone 100% A (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM sodio fosfato pH 7.0, 5% isopropanolo) per 5 min. Mix 15 µ l (67 pmol) di una soluzione di 1 mg/mL di trastuzumab (CypK) 2 con 15 µ l di 2 x tampone A in un flaconcino. Quindi programmare un’iniezione di 10 µ l in HPLC. Eluire in un flusso di 1 mL/min isocratica con 100% tampone A per 1 min seguita da una sfumatura di 15 min da 100 a 0% di tampone A in B (50 mM sodio fosfato pH 7.0, 20% isopropanolo). Monitorare l’eluizione a 280 nm. Calcolare il DAR integrando il picco corrispondente a ciascuna specie e utilizzando le aree risultanti nella seguente equazione:DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2)/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 … trastuzumab(MMAE)2)Tempo di ritenzione previsto per trastuzumab(CypK)2 è min 7.5-8.0, per trastuzumab (CypK, MMAE) è 9.1-9.6 min, e per trastuzumab(MMAE)2 è 10.5-11.0 min. Analizzare il coniugato di LC-MS Deglycosylate 30 µ l di 1 mg/mL ADC e l’anticorpo non modificato in non riducenti condizioni con 250 PNGase F unità per almeno 6 ore a 37 ° C. Eluire l’anticorpo nello spettrometro di massa in una C4 1-5 µm 1.0 x 100 millimetri di colonna utilizzando un gradiente di 20 min di 2% all’80% acetonitrile in acqua. Acquisire dati con un intervallo di m/z di 350-4000 in modalità ioni positivi con una tensione di cono di 150v. Deconvolute i dati non elaborati utilizzando il software appropriato. Calcolare la differenza di massa tra la modifica e gli anticorpi non modificati. 3. analisi stabilità del collegamento Dihydropyridazine in Trastuzumab(TAMRA)2 in siero Filtrare il siero utilizzando un filtro di 0,22 μm in condizioni sterili. È possibile aggiungere 100 unità/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. Riempire i pozzetti esterni di una piastra a 96 pozzetti con acqua. Nei pozzetti centrali, mescolare in triplice copia 90 µ l di siero filtrato con 10 µ l di 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2 in PBS ad una concentrazione finale di 0,1 mg/mL. Posizionare la piastra in un incubatore saturato di umidità a 37 ° C e 4-5% di CO2. Ogni 24 ore nel corso di 5 giorni, dispensare ogni bene accuratamente per mescolare, prendere un 5 µ l aliquota, flash-congelamento con azoto liquido e conservare a-80 ° C. Una volta che tutti i campioni sono stati raccolti, scongelare le aliquote e analizzare utilizzando un test ELISA indiretto come precedentemente segnalati12 con alcune modifiche: Ricoprire una piastra a 96 pozzetti durante la notte con HER2 0,25 µ g/mL a 4 ° C. Tutti gli altri passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente. Il giorno seguente, lavare 5 volte con PBS 0.05% tween (PBS-T) e bloccare con albumina di siero bovino 1% per 1 h. Lavare e incubare i campioni a una diluizione 1: 10000 in PBS per 2 h. Lavare e incubare un anticorpo anti-TAMRA alzato nel topo alla diluizione di 1: 2000 in PBS-T con 0,5% BSA per 1 h. Lavare e incubare un anti-topo HRP a coniugato 1: 1000 in PBS-T con 0,5% BSA per 1 h. Aggiungere TMB e lasciare per agire 5-10 min. Interrompere la reazione con 50 µ l di H2così4 1 M e misura di assorbanza a 450 nm. Sottrarre il fondo misurati a 570 nm. Montare una curva di regressione logistica 4 parametri per diluizioni standard e interpolare le misure da campioni.Nota: La stabilità del trastuzumab(MMAE)2 poteva essere valutata usando lo stesso protocollo modificando il dosaggio descritto al punto 3.3 per un kit ELISA commerciale per misurare la concentrazione di ADC. 4. valutare la citotossicità di ADC Nota: Questo protocollo è basato su analisi precedentemente segnalati23,26 con alcune modifiche. Scongelare le cellule MCF-7 e SK-BR-3 e consentire loro di stabilirsi nel p25 recipienti contenenti la sostanza completa, cioè inattivato DMEM completati con calore 10% siero bovino fetale, 100 unità/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Dividere le celle alla confluenza di 80-90% (ogni 3-4 giorni) almeno 2 volte prima del dosaggio. Due giorni prima del test, riempire l’esterno dei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con acqua. Quindi ascensore cellule con tripsina 0.05% a 0,5 mM EDTA, centrifuga 3 min a 250 x g, risospendere in nuovo mezzo e seme 3000 cellule in 100 µ l per pozzetto (vuoto) in piastre da 96 pozzetti. Due giorni dopo la semina delle cellule, preparare 10 diluizioni seriali di tutti i campioni in triplice copia con 0,1% DMSO in terreno completo. Considerare i seguenti campioni e controlli: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, trastuzumab wild-type, tetrazine-vcMMAE e MMAE. Aggiungere 100 µ l di ciascun campione in ciascun pozzetto e incubare per 5 giorni a 37 ° C e 4-5% di CO2. Il giorno 5, misurare la vitalità cellulare. A tal fine, utilizzare un kit commerciale per lisare le cellule e misurare l’ATP rilasciato. Tracciare la percentuale del segnale rispetto alle cellule di controllo trattati con 0,1% DMSO.Nota: ADC può essere incubate per 5 giorni nel siero e analizzati per citotossicità dimostrare la stabilità funzionale.Attenzione: MMAE è altamente tossico. Pertanto utilizzare guanti e occhiali protettivi quando si maneggia derivati MMAE. Se si utilizza MMAE non modificato come controllo dell’esperimento, quando si prepara la soluzione di riserva in DMSO, gestire il prodotto solido all’interno di una cappa aspirante.

Representative Results

Il sistema di espressione transiente segnalati (Figura 1a) produce 22 ± 2 mg di trastuzumab(CypK)2 per litro di terreno di coltura, che rappresenta 2/3 dell’anticorpo tipo selvaggio prodotta nelle stesse condizioni (Figura 1C). La linea cellulare stabile può aumentare questo rendimento fino a 31 ± 2 mg/L21. Trastuzumab(CypK)2 può essere coniugato con tetrazine-vcMMAE, che produce quasi omogenea trastuzumab(MMAE)2 all’interno di 3 h a 25 ° C (Figura 2). L’elevata idrofobicità di questo citotossina richiede aggiunta di 10% acetonitrile quando 5 o più equivalenti molari della tossina a CypK sono usati. In alternativa, la cicloaddizione è inoltre completata entro 20 h utilizzando 2 equivalenti di tetrazine-vcMMAE senza acetonitrile (Figura 2C). Trastuzumab(CypK)2 reagisce con tetrazine-TAMRA entro 2 h a 25 ° C e 3-6 h sono necessari quando la temperatura è diminuita a 4 ° C (Figura 3C). Il DAR previsto per trastuzumab(MMAE)2 misurato da HPLC-HIC è 1,9 (Figura 2b). Il picco osservato inizialmente nel cromatogramma a 8,0 min rappresenta l’anticorpo non coniugata (DAR 0) e dovrebbe sono completamente scomparse quando la reazione è stata completata. Le specie con DAR 1 eluisce a 9.1-9.6 min e dovrebbero avere un’area 90%. La fluorescenza in gel di SDS-PAGE e spostamento di mobilità conferma l’incorporazione di TAMRA (Figura 3b) e l’identità dell’efattori è verificata mediante LC-MS (figura 2d-e e figura 3d). Incubazione di trastuzumab(TAMRA)2 per 5 giorni nel siero umano e la successiva analisi di ELISA conferma che il payload rimane attaccato all’anticorpo (Figura 4b). Per quanto riguarda l’analisi di citotossicità, trastuzumab(MMAE)2 Mostra ad alta potenza in seno di SK-BR-3 (HER2 alta) le cellule tumorali, con una mezzo efficace concentrazione massima (CE50) di 55 ± 22 (Figura 4D). Trastuzumab(MMAE)2 mantiene la citotossicità dopo 5 giorni di incubazione nel siero umano (Figura 4c). Al contrario, quando l’ADC è analizzato su MCF-7 (HER2 basso) il CE50 è 200 volte più basso (Figura 4D). L’anticorpo di tipo selvaggio e trastuzumab(CypK)2 tetrazine-vcMMAE mostrano tossicità estremamente bassa (4e e figure 4 d), mentre MMAE Visualizza alta citotossicità non selettivi in entrambe le linee cellulari (Figura 4e). Figura 1: sistema di espressione transiente. R. regioni interessate dei plasmidi utilizzati per trasfezione transiente in cellule HEK293. CMV: promotore citomegalovirus, WPRE: Marmotta epatite Virus Posttranscriptional elemento regolatore, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: specifico promotore, PylRS: pyrrolysil tRNA sintetasi, > e <: direzione della trascrizione. B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). C. risultato dell’espressione di trastuzumab wild type (WT) e trastuzumab(CypK)2 come misurato in un western blot dopo proteina una purificazione. Barre di errore rappresentano la deviazione standard dei triplici copie biologiche. Questa figura è stata modificata con il permesso di Oller-Salvia et al. 201821. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Coniugazione di trastuzumab(CypK)2 con tetrazine-vcMMAE. R. inverso elettrone-domanda cicloaddizione di Diels-Alder tra il residuo CypK con l’anticorpo e la derivata di tetrazine di MMAE. I gruppi di reazione sono evidenziati in rosso, p- aminobenzylalcohol è raffigurato in verde e il dipeptide valina-citrullina in blu. B. cromatogrammi HPLC-HIC Mostra l’avanzamento della coniugazione dell’anticorpo. C. grado di conversione per quanto riguarda il DAR massimo 1,9 utilizzando reagenti differenti concentrazioni. D-E. Riconducibili, spettri di massa dell’anticorpo Full-Length prima e dopo la coniugazione. Trastuzumab(CypK)2 è stata ottenuta utilizzando la linea cellulare stabile. Questa figura è stata modificata con il permesso di Oller-Salvia et al. 201821. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Coniugazione di trastuzumab(CypK)2 con tetrazine-TAMRA. R. inverso elettrone-domanda cicloaddizione di Diels-Alder tra il residuo CypK con l’anticorpo e la derivata di tetrazine di TAMRA. B. SDS-PAGE gel che mostra lo spostamento di mobilità e la fluorescenza in gel ha provenuto dalla coniugazione di TAMRA. C. cinetica di coniugazione a due diverse temperature. Spettro di massa Deconvoluted D. di trastuzumab(TAMRA)2. Trastuzumab(CypK)2 è stata ottenuta utilizzando la linea cellulare stabile. Questa figura è stata modificata con il permesso di Oller-Salvia et al. 201821. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: stabilità nel siero e citotossicità di trastuzumab coniugati. R. fumetto evidenziando le funzionalità desiderate in un ADC interiorizzazione. B. stabilità di trastuzumab(TAMRA)2 nel siero umano come misurato in ELISA. C. analisi di attuabilità delle cellule con trastuzumab(MMAE)2 dopo 5 giorni in siero umano (+ siero, nero). Un campione di controllo incubati in PBS invece di siero (-siero, rosso) è stato incluso nell’analisi della stessa. D. analisi di attuabilità delle cellule con campioni anticorpo fresco diluito. E. analisi di attuabilità delle cellule con i derivati MMAE fresco diluiti. Barre di errore rappresentano l’errore standard della media dei 3 esperimenti indipendenti. Questa figura è stata modificata con il permesso di Oller-Salvia et al. 201821. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La procedura di espressione transiente per produrre trastuzumab(CypK)₂ descritto in questo protocollo è semplice e consente elevata modularità. I rendimenti ottenuti sono all’interno di quelli previsti in un ambiente accademico²⁷ e linee cellulari stabili possono essere generate per migliorare ulteriormente il rendimento di produzione²¹. Durante espressione, concentrazioni di CypK inferiori a 5 mM può risultare in inferiore incorporazione di ncAA, e importi superiori possono influenzare la crescita delle cellule e diminuire i rendimenti dell’anticorpo. CypK come un aminoacido ha bassa solubilità in acqua, così dovrebbe essere dissolto in primo luogo a 100 mM in 0.1 M NaOH e quindi aggiunto al terreno di coltura. Dopo diluizione CypK nel mezzo e prima di aggiungerlo alle cellule, è fondamentale per neutralizzare il mezzo con HCl e filtro per sterilizzare. Successivamente, utilizzando i reagenti di transfezione specificate nel presente protocollo e seguendo i tempi di incubazione raccomandati dal fabbricante è importante per un’espressione ad alto rendimento. Per ulteriori dettagli su espressione transitoria di anticorpi umani, si rinvia a altri protocolli pubblicati³¹^,³².

Quando l’anticorpo è purificato, un elevato eccesso di resina di proteina A è richiesto come indicato per garantire completo anticorpo tirare giù dal surnatante. Al fine di evitare la precipitazione di trastuzumab durante l’eluizione, è raccomandabile utilizzare una soluzione con il buffer ad alta capacità, diluire immediatamente con PBS e scambiare il buffer evitando un’eccessiva concentrazione. Tenere sempre l’anticorpo < 5 mg/mL.

La coniugazione di trastuzumab(CypK)₂ con tetrazine-vcMMAE è più veloce rispetto la maggior parte delle reazioni avverse riportate con altri handle bioorthogonal per ADC. Inoltre, questa cycladdition si verifica in condizioni blande: temperatura ambiente o inferiore e fisiologico del pH. È importante diluire le soluzioni stock di DMSO dei reagenti con acetonitrile prima dell’aggiunta di PBS e l’anticorpo; in caso contrario i derivati tetrazine precipiterà. L’acetonitrile è richiesto solo dovuto l’alta idrofobicità di MMAE e TAMRA, ma meno molecole idrofobiche potrebbero non essere necessario l’aggiunta di un co-solvente. In alternativa, può essere coniugata tetrazine-vcMMAE senza acetonitrile e molari solo 2 equivalenti di tetrazine-vcMMAE all’interno di 20 h. Questa piccola quantità di tossina potrebbe comportare una diminuzione sostanziale del costo di produzione di ADC rispetto alle attuali tecnologie basate su ncAA. Trastuzumab(CypK)₂ è completamente reattivo per almeno 4 mesi quando conservato a 4 ° C.

HPLC-HIC consente una determinazione accurata di DAR poiché MMAE è altamente idrofobo e fornisce un’eccellente risoluzione dei picchi corrispondenti anticorpi coniugati con le tossine di 0, 1 e 2. Non reagiti tetrazine-vcMMAE eluisce circa 13,7 min e viene rilevato a 280 nm. Questa tecnica richiede un materiale di partenza con elevata purezza. Inoltre, non è raccomandabile per placare la reazione con altre molecole tetrazine-reattive come BCN-OH poiché possono alterare i tempi di ritenzione e la forma delle cime. È essenziale che la concentrazione di sale dei campioni corrisponde a quello nella fase mobile all’inizio della sfumatura al fine di ottenere una buona separazione, soprattutto se vengono iniettati più di 10-20 µ l.

Per quanto riguarda l’analisi LC-MS, deglycosylation dei campioni anticorpo è necessaria per ottenere un singolo picco su deconvoluzione dello spettro grezzo. La precisione del totale dell’anticorpo e masse di ADC può variare a seconda la calibrazione dello strumento. Quindi, al fine di calcolare la massa per la modifica, sottrarre la massa ottenuta per gli anticorpi non modificati da quello ottenuto per l’ADC. Spettrometri di massa ad alta risoluzione moderni dovrebbero fornire un errore relativo inferiore a 1: 10000. LC-MS può essere utilizzata anche per calcolare il rapporto tra le diverse specie, questo valore è solitamente una sopravvalutazione perché la modifica può influenzare la capacità di ionizzazione della specie generato e basse quantità di impurità potrebbero non essere rilevate.

La stabilità del linker in ADC è fondamentale perché il rilascio prematuro della droga provoca tossicità più elevata e minore efficacia; la citotossina gratis danneggia tessuti sani e l’anticorpo nudo compete con quello armato per i siti di legame di destinazione su cellule malate. Un rilascio inferiore al 5%, che è all’interno della variabilità del dosaggio stabilità, dovrebbe essere previsto.

Infine, la selettività di un ADC destinazione HER2 come trastuzumab(MMAE)₂ può essere valutata confrontando la citotossicità in cellule di SK-BR-3 (HER2 alta) e cellule MCF-7 (HER2 basso) poiché quest’ultimo express 15 volte meno recettori HER2 del precedente²⁸. Il immunoconjugate dovrebbe risultare in una vitalità cellulare almeno 2 ordini di grandezza inferiori a SK-BR-3 rispetto a MCF-7. La CE₅₀ SK-BR-3 dovrebbe essere nella gamma nanomolar a due cifre che riflette l’elevata potenza di questo ADC²⁹^,³⁰. L’anticorpo non modificato, trastuzumab(MMAE)₂ o trastuzumab, non dovrebbe mostrare nessuna tossicità in questo test. Tetrazine-vcMMAE dovrebbe avere un effetto 3 ordini di grandezza inferiore a ADC poiché il linker rimuove l’attività della tossina peptidomimetici. Al contrario, poiché MMAE è in grado di permeare la membrana cellulare³⁰, dovrebbe avere una tossicità simile all’ADC ma non visualizzare alcuna discriminazione tra HER2 alta e bassa di cellula HER2. Inoltre, se questo test viene fatto dopo un’incubazione di 5 giorni di ADC in siero, può essere utilizzato per fornire una prova funzionale della stabilità del linker: un rilascio della tossina si tradurrebbe in una una diminuzione nell’efficienza di ADC in SK-BR-3 se MMAE è stato rilasciato con p arte del linker o una diminuzione della selettività se il linker è stato fenduto in una moda traceless.

La tecnologia ADC descritta nel presente documento permette l’incorporazione efficiente e site-specific di un derivato del ciclopropene di lisina in IgG1s. A seguito di una purificazione facile, gli anticorpi possono rapidamente coniugati con molecole contenenti tetrazine, producendo prodotti omogenei. A causa della piccola dimensione e alta reattività del ciclopropene minimal manico, questo metodo dovrebbe permettere la coniugazione di payload stericamente. Gli efattori risultante sono stabili nel siero e sono altamente potente e selettivo. Nel complesso, CypK consente un collegamento veloce, stabile e site-specific bioorthogonal per l’anticorpo e altri coniugati di proteina per essere utilizzato in terapia o diagnosi.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal Medical Research Council, UK. B.O.-S. detiene un fellowship EMBO (ATLF 158-2016) ed è grato a H. Pelham e J.W. mento per il supporto e di G. Kym, C. W. Morgan e O. Perisic per aiuto e consigli.

Materials

Expi293F	ThermoFisher Scientific	A14527	HEK suspension cells
Expi293 Expression Medium	ThermoFisher Scientific	A1435101	Expression medium
Antibiotic-antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062	Penicillin-streptomycin-amphotericin B
125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap	Corning	431143	Shake flasks
Brunswick S41i incubator	Eppendorf	S41I230011	CO2 incubator with a shaker
Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution	VWR	191373M
Cyclopropene lysine	Sichem	SC-8017	In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014
Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated	Merck Millipore	SCGP00525
Opti-MEM, Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985070	Reduced serum medium
ExpiFectamine 293 Transfection Kit	ThermoFisher Scientific	A14525	Transfection reagent
5810 R centrifuge	Eppendorf	5811000460
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized	Merck Millipore	SLGP033RS
Protein A resin	Sino Biological	10600-P07E-RN-25
Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50	Bio-Rad	7311550	Polypropylene chromatography column
Econo-Column Funnel	Bio-Rad	7310003
Sodium citrate	Fluka	71635
ÄKTA explorer FPLC	GE Healthcare
HiTrap HIC Selection Kit	GE Healthcare	28-4110-07	Includes HiTrap 1 mL Butyl HP
Ammonium sulfate	VWR	2133.296
Isopropanol	Honywell	34863-2.5L
Dymethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
Tetrazine-vcMMAE	ChemPartner	–	Costum synthesized
Tetrazine-5-TAMRA	Jena Bioscience	CLK-017-05
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well	ThermoFisherScientific	NP0321BOX
Xcell SureLock Mini-Cell	ThermoFisherScientific	EI0001
UltiMate 3000 HPLC	ThermoFisherScientific
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm	ThermoFisherScientific	088553
PNGase F	New England BioLabs	P0704S
NanoAcquity	Waters
C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column	Waters
96-well microplates for cell culture	ThermoFisherScientific	156545
Human serum	Sigma-Aldrich	H4522-20mL
CO2 incubator	Panasonic
HER2 ECD	Sino Biological	10004-HCCH
Anti-TAMRA	Abcam	an171120
Anti-mouse HRP	Santa Cruz	sc-2005
TMB	BioLengend	421101
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	84727-500ML
PHERAstar FS	BMG Labtech		Plate reader
DMEM	Sigma-Aldrich	D5671-500ML
SK-BR-3	ATCC	HTB-30
MCF-7	ATCC	HTB-22
CellTiterGlo 2.0 Assay	Promega	G9242	Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence.
Monomethyl Auristatin E	Cayman Chemical	16267
NanoDrop 2000	ThermoFisherScientific		Microvolume spectrophotometer
Human IgG ELISA Quantificaiton Set	Bethyl	E80-104
MaxEnt1 in MassLynx	Waters		Software application for mass spectrum deconvolution
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay)	Epitope Diagnostics, Inc.	KTR 782
Tube 50 mL, 114x28mm, PP	Sarstedt	62.547.254	Conical tube
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL	Merck	UFC905024	Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL	Merck	UFC805024	Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification)
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	ThermoFisherScientific	89882	Size exclusion spin columns
Tube PCR 0.2ml Flat Cap	Thistle Scientific Ltd	AX-PCR-02-C-CS	PCR tubes
Nunc MaxiSorpª flat-bottom	ThermoFisherScientific	44-2404-21	Plates for ELISA

Referências

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Citar este artigo

Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. J. Vis. Exp. (139), e58066, doi:10.3791/58066 (2018).