Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Benjam&#237; Oller-Salvia

doi:10.3791/58066

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Química

빠른 Bioorthogonal 반응을 통해 변화 항 체 의약품의 세대에 대 한 정식이 아닌 아미노산의 유전자 인코딩

Published: September 14, 2018

doi:

10.3791/58066

Benjamí Oller-Salvia¹

¹Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology

Summary

항 체에 신의 cyclopropene 파생 통합 tetrazine 베어링 분자 생성 항 체 약물 어원이 같은 말의 사이트별, 신속 하 고 효율적인 결합 수 있습니다.

Abstract

마약 항 체 어원이 같은 말 (Adc) 임상 연습에서 현재 사용 되는 여러 다른 위치에서 독에 연결 하는 항 체 분자의 혼합물. 전 임상 연구 치료 인덱스 이러한 전통적인 Adc의 독 소의 사이트 연결 향상 시킬 수 있습니다 나타났습니다. 그러나, 현재 접근 균질 Adc를 생산 하는 낮은 단백질 표정, 느린 반응 속도 론 등 여러 제한이 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 항 체 유전자 코드 확장을 사용 하 여에 리 (CypK)의 cyclopropene 파생을 통합 하는 식의 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다. 이 최소한의 bioorthogonal 핸들 역 수요 Diels 오리 나무 cycloaddition 통해 tetrazine 파생 상품의 급속 한 활용 가능 여기 보고 식 시스템에 손쉬운 생산과 trastuzumab 무거운 체인의 각 CypK 베어링의 정화 수 있습니다. 우리는 독 소 monomethyl auristatin 전자에 항 체를 연결 하 고 소수 성 상호 작용 착 색 인쇄기 질량 분석에 의해 immunoconjugate를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 활용에서 발생 하는 dihydropyridazine 결합의 인간 혈 청에서 안정성을 평가 하 고 HER2 수용 체의 상부를 가진 유방암 세포에 대 한 ADC의 선택적 세포 독성 테스트 분석을 설명 합니다.

Introduction

마약 항 체 어원이 같은 말 (Adc) biotherapeutics의 선택도 및 작은 세포 독성 분자의 힘을 결합 한다. 대부분의 Adc는 암 세포¹DNA 또는 microtubule 중 합에 영향을 주는 약물을 대상으로 전통적인 화학 요법의 부작용을 감소 하고자 합니다. 식품의 약 청 (FDA)에 의해 승인 세대 Adc 감소 pharmacokinetic 속성²다른 위치에 분자의 혼합물을 생성 하는 lysines 및 시스테인, 수정에 의존 합니다. 대조적으로, 항 체 약품의 사이트 활용 향상 된 치료 indeces³^,⁴화합물을 생성할 수 있습니다. 균질 Adc를 생산의 문제 해결을 추구, 몇 가지 선택적 화학과 효소 수정을 보고¹^,⁵되었습니다. 그러나, 현재 방법 수 대상 항 체에만 특정 위치, 낮은 단백질 표정에서 고통을, 낮은 안정성, 링커 제공 또는 느리고 낮은 저조한 반응에 의존.

유전자 코드 확장을 통해 비정규 아미노산 (ncAA)의 수 있습니다 잠재적으로 생성 하는 데 사용 하는 다른 방법의 한계를 극복 하는 단백질으로 bioorthogonal 반응 그룹의 과다의 사이트별 설치를 Adc입니다. 인코딩 대상 (중지) 코 돈에 대응에서 ncAAs 정식 아미노산⁶통합 생 쌍을 직교 하는 aminoacyl-tRNA 합성/tRNA 쌍에 의존 합니다. 여러 ncAAs Adc 생성 항 체에 통합 되었습니다. 그러나, 가장 치료 약물 활용에 응용 프로그램에 대 한 다양 한 부채에서 고통. p-acetylphenylalanine (pAcF)⁷^,⁸ 아니다 완전히 bioorthogonal, 낮은 pH (4.5)와 긴 반응 시간 (> 60 h), p-azidophenylalanine (pAzF)⁷^,^,⁹¹⁰, 등 azides 동시에 요구 p-azidomethylphenylalanine (pAMF)¹¹및 lysine (AzK)¹²^,¹³ 의 아 지 드 파생 셀¹⁴에서 감소 될 수 있습니다 및 Huisgen cycloadditions를 촉매 하는 데 사용 하는 구리 산화 손상을 일으킬 수 있다 ¹⁵.

대체 ncAAs 트랜스-cyclooctene (TCO)에 따라, cyclooctyne (SCO)와 bicyclo [6.1.0] nonene (BCN) 최근 인코딩되어 항 체에 바이오 이미징 목적, 표현 시스템 매우 낮은 수율 (0.5 mg/L)¹⁶에서 겪고 있다. 또한, cyclooctenes와 cyclooctynes는 큰 및 집계-ADC 페이로드에 대 한 ADC의 민감성을 증가 시킬 수 있습니다 소수 성 처리는 전통적으로 소수 링커의 물리 화학적 특성을 크게 표시 되었습니다. 약 동학 및 치료 인덱스¹⁷영향. 대조적으로, 1, 3-disubstitued cyclopropenes은 작은 반응 그룹 단백질 구조와 physichochemical 속성¹⁸에 최소한의 변경 발생입니다. Cyclopropenes 역 전자-수요 Diels 오리 나무 cycloaddition¹⁹통해 tetrazines와 선택적으로 그리고 급속 하 게 반작용 한다. 이 프로토콜에서 우리가 만드는 작은 메 틸 cyclopropene 더 큰 긴장된 불포화 주기 보다 입체 방해에 의해 영향을 하 고 1-30 M^-1의^{순서 반응 속도 상수 lysine (CypK, 그림 1b) 베어링의 파생의 사용 -1} 수성 미디어¹⁸^,²⁰에서.

우리는 최근 CypK tetrazine 베어링 분자²¹이 최소 bioorthogonal 핸들 반응 하 여 Adc를 생성 하는 항 체로 통합 하는 방법을 했다. 여기는 가장 어려운 단계에 중점을 두고 좀 더 자세하게 ADC 준비 절차에 설명합니다. CypK의 pyrrolysyl-tRNA 합성 (PylRS)를 사용 하 여 이동은 / tRNA_CUA(PylT) 쌍 항 체 무거운 사슬에 도입 하는 호박 codon에 대 한 응답에서 (HC)²². 여기 두 개의 플라스 미드 사용 하 여 (그림 1a) 과도 transfection, 하나는 항 체의 무거운 체인 인코딩 인코딩 모두 포함 된 PylRS/PylT 카세트 빛 체인 (LC), 다른 하나에 대 한. 또는, 더 높은 항 체 수익률을 가능 하 게 안정적인 셀 라인²¹더 힘 드는 절차 통해 생성할 수 있습니다.

상기 식 시스템 1 (IgG1) 치료 안티 HER2 면역 글로불린을 생산할 수 있는 trastuzumab 야생 유형 항 체를 비슷한 수준에서 CypK와 함께. 우리는 ncAA (HC-118TAG)를 인코딩하는 데 무거운 체인 CH1 도메인의 첫 번째 위치를 선택. 하지만 이것은 Adc²³ 에 가장 일반적으로 수정 된 사이트와 HC-118 (EU 번호)로 알려져 있다 되었습니다 라고도 HC-121 (시퀀스 위치)와 HC-114 (Kabat 번호)²⁴. 이 위치는 모든 IgG1s에 걸쳐 보존은, 이후 이러한 식 시스템 의무가 가장 치료 항 체 이어야 한다입니다.

우리는 trastuzumab(CypK)₂ 수 쉽게 순화 될 단백질에 의해 한 뒤 소수 성 상호 작용 열 (FPLC-HIC)와 고속 단백질 액체 크로마토그래피에 의해 표시. 그 후 항 체 covalently microtubule 중 합 억제제 monomethyl auristatin E (MMAE), FDA 승인 ADC Adcetris에서 사용 되는에 3 h 이내 연결 된다. 여기 우리가 사용 MMAE (tetrazine-vcMMAE)의 벤 질 tetrazine 파생 링커 glutarate 스페이서 및 valine 시트 룰 린 효소 정한 구성 요소 뒤에 p-aminobenzylalcohol self-immolative 단위; 이 링커는 독 소²⁵traceless 릴리스 결과 ADC의 국제화에 따라 리소좀에 Cathepsin b 죽 습. 반응의 광범위 한 범위를 보여, 항 체는 또한 fluorophore tetramethylrhodamine (TAMRA)에 연결 됩니다. 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LC-MS)를 결합 하 여는 공액의 정체성을 확인 하 고 소수 성 상호 작용 열 (HPLC-HIC)와 고성능 액체 착 색 인쇄기를 사용 하 여 약물을 항 체 비율 (DAR)을 계산 하는 방법을 설명합니다 .

항 체 성능 특성화의 일환으로, 우리는 인간의 혈 청에 dihydropyridazine 연결의 안정성을 테스트 하는 방법을 설명 합니다. 간단한 ELISA에 의해 정해질 수 있습니다 및 결과의 해석 하지 trastuzumab(MMAE)₂의 효소 정한 구성 요소에 의해 복잡 하 게 하기 때문에이 매개 변수는 더 쉽게 trastuzumab TAMRA에 평가 됩니다. 마지막으로, 선택도 및 trastuzumab(MMAE)₂ 의 힘 HER2의 다른 레벨을 표현 하는 셀 라인에 걸쳐 ADC의 cytoxicity를 비교 하 여 평가 됩니다. 이 분석 결과 인간의 혈 청에 immunoconjugate 잠복기 후 수행 하는 경우 ADC 안정성의 기능 증명을 제공 합니다.

Protocol

1. 생산 및 항 체의 특성 항 체를 표현 표현 매체와 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 250 ng/mL 암포 8% CO2 에서 37 ° C에서 셀 습도 incubators 장착 B. 유지 보충의 50 mL를 포함 하는 250 mL 플라스 크에 HEK 현 탁 액 셀의 유리병을 녹여 125 rpm에서 쉐를 커와 함께 Transfecting 전에 셀 0.3-0.5 x 106 셀/mL (2-3 일 마다)을 2 회 이상 분할. 때 2.5 x 106 셀/mL의 조밀도 도달된 (2-3 일 분한 후), 100 mM CypK의 신선한 솔루션을 준비입니다. 이 목적을 위해 CypK의 64 밀리 그램의 무게, 복구 모든 소화 입자를 sonicate 내려 0.1 나트륨 수산화, 소용돌이, 스핀의 2.5 mL를 추가 합니다. 항생제로 보충 하는 표현 매체의 42.5 ml CypK (0.1 M NaOH에 100 m m)의 2.5 mL를 추가 합니다. 잘 섞어, 0.1 M HCl의 250 µ L을 추가 하 고, 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. HC 및 LC pKym1 플라스 미드21 감소 된 혈 청 매체와 2.5 mL를 50 µ g을 희석. 별도 튜브에 감소 된 혈 청 매체와 2.5 ml transfection 시 약의 135 µ L를 희석. 솔루션을 준비 후 5 분 믹스는 플라스 미드와 transfection 시 솔루션 및 DNA와 transfection 시 사이 단지의 형성 수 있도록 20 분 동안 품 어. 한편, x 500g에 5 분 동안 대상 밀도에서 125 백만 세포를 원심, CypK를 포함 하는 표현 매체와 resuspend 고 DNA-transfection 시 혼합물을 추가 합니다. CypK 구입 하거나 이전18보고 합성 될 수 있습니다. 20 h에 대 한 셀을 잠복기 후 transfection 시 강화 키트에 포함 된의 250 µ L를 추가 합니다. CypK (매체의 변화가 식은 동안 필요)의 추가 후에 표면에 뜨는 6-7 일에서 항 체를 수확.* 또는 높은 하 고 더 일관 된 수익률을 얻으려면, 안정적인 셀 라인 생성 될 수 있습니다 Oller 샐비어 외 에 설명 된 대로 201821. 이 경우에, trastuzumab(CypK)2 식 매체 m m CypK 5의 추가 의해 간단 하 게 표현 된다. 항 체 정화 3000 x g에서 15 분 동안 셀 원심 필터는 0.45 또는 0.22 μ m 필터 상쾌한. 필터 차단 되는 경우 새로운 한 그것을 대체 하 고 필터링을 계속 합니다. 이 몇 밀리 리터 후 경우, 원심 7000 x g에서 추가로 15 분에 대 한 상쾌한. 빈 폴 리 프로필 렌 크로마토그래피 칼럼에서 단백질 A 수 지 (2 mL/100 mL의 상쾌한)를 추가 하 고 비드 워시 버퍼 (0.1 M 인산 나트륨, 150 mM NaCl)의 적어도 5 볼륨 수 지 equilibrate. 두 50 mL 원뿔 관으로는 상쾌한 분할 하 고 뒤에 미리 equilibrated 단백질 A 수 지 비드 워시 버퍼 (0.5 M 나트륨 인산 염, 150 mM NaCl) x 5를 추가 합니다. 풀 다운은 상쾌한에 항 체를 상 온에서 3 h에 대 한 롤러에 원뿔 튜브를 놓습니다.또는: 수 지의 권장 량이 적어도 두 배 열에는 상쾌한을 추가 하 고를 통해 흐름을 허용. SDS 페이지 상쾌한에 남아 있는 항 체의 상당한 아니다 다는 것을 확인 하십시오. 있다면, 다시 한 번 수 지 통해 상쾌한 elute. 열에는 상쾌한 수 지 단백질 A 전송 하 고 액체를 통해 흐름을 허용. 워시 버퍼 (또는 적어도 10 수 지 볼륨) 25 mL를 추가 하 고를 통해 흐름을 허용. 4 mL의 0.1 M 나트륨 구 연산 염, 3, 1 M 인산 염 버퍼, 150 mM NaCl의 1 mL에 pH와 항 체 elute PBS의 10 mL와 항 체 희석, 0.5-1 집중 원심 여과 및 exchange 버퍼 PBS 세 번 하 여 mL. FPLC 0.5 mL/min와 0-100의 흐름으로 부 틸 HIC 열을 사용 하 여 샘플을 정화 높은 소금 버퍼에 낮은 소금 버퍼 (50 m m 인산 나트륨 pH 7.0, 20% 소 프로 파 놀)의 30 분 기온 변화도 % (1.5 M (NH4)2등4, 50 m m 인산 나트륨 pH 7.0 5% 소 프로 파 놀). 모든 분수를 수집 하 고 모니터링 280에서 차입 nm. 소량 (< 1 mg) 수율 및 순도 최대화 하기 위해 2.4에 설명 된 조건에서 HPLC HIC와 정화 수 있습니다. 포함 하는 항 체, PBS 가진 적어도 4 mL에 희석 원심 여과 및 교환 버퍼 PBS 세 번 하 여 집중 분수 풀. 항 체를 계량 280에서 흡 광도 측정 하 여 대략적인 농도 구하는 nm 마이크로 볼륨 분 광 광도 계를 사용 하 여. 정확 하 게 측정 해야 하는 경우 인간의 IgGs를 측정 하는 ELISA 키트를 사용 합니다. 대략적인 견적에 대 한 SDS 페이지 Coomassie 기반 얼룩으로 다음과 같이 사용. 1 mg/mL에서 ELISA에 의해 계량 trastuzumab 표준 6 배 두 배를 diluting 하 여 표준을 준비 합니다. 표준 및 샘플을 로딩 버퍼 줄이는 약 0.25 mg/mL에서 끓인 다. 사용 하 여 4-12% 두번째-트리 스 SDS 페이지에 그들을 실행 MES SDS 버퍼와 Coomassie 기반 염료와 얼룩. 마지막으로 빛 또는 무거운 체인 ImageJ를 사용 하 여 해당 밴드의 색상 밀도 측정 하 고 표준 곡선의 샘플에서 신호 보간. 4 ° c.에 항 체를 저장 2. 항 체 단백 결합 하 고 ADC를 특성화 Tetrazine-방위 분자와 항 체 켤레 20 µ L의 이기와 작은 원뿔 튜브 (예를 들어,PCR 튜브)에 PBS의 76 µ L tetrazine-vcMMAE (4 µ L, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 3.4 m m)의 10 어 금 니 동등을 희석. Trastuzumab(CypK)2 (100 µ L, 2mg/mL PBS에)의 1 어 금 니 동등을 추가 하 고, 철저 하 게 혼합 trastuzumab(MMAE)2를 실 온 (25 ° C)에서 3 h 반응 허용.참고: tetrazine-5-TAMRA 같은 다른 분자는 tetrazine-vcMMAE이이 프로토콜을 사용 하 여 대신 항 체에 연결할 수 있습니다. ADC를 정화 사전에 제조업체의 지침에 따라 PBS를 가진 크기 제외 스핀 열 equilibrate. 스핀 열과 1 분 1500 x g에서 원심 분리기에는 반응의 전체 볼륨을 추가 합니다. SDS 페이지 여 켤레를 분석 하 고 ADC를 계량 1.3.2에 설명 된 대로 ADC를 계량. SDS 페이지에 빛 체인의 색상 밀도 측정 하 여 표준 곡선에 대 한 수정 되지 않은 항 체를 사용 하 여. 무거운 사슬 한다 약간 이동 했다는 활용에 따라 분자 무게가 증가 보여주는.참고: trastuzumab(TAMRA)2와 같은 fluorophore와 항 체를 수정 하는 경우만 해당 하는 무거운 체인 밴드 얼룩이 지기 전에 젤에 형광을 표시 해야 합니다. HPLC hic 공액 분석 100% 버퍼 A와 HPLC HIC 열 equilibrate (1.5 M (NH4)2등4, 50 m m 인산 나트륨 pH 7.0, 5% 소 프로 파 놀) 5 분. 혼합 15 µ L (67 pmol) trastuzumab (CypK) 2 15 µ L의 2 배와 1 mg/mL 해결책의 버퍼는 유리병에 A. 다음에 HPLC에서 10 µ L 주입 프로그램. 1 분 뒤 15 분 그라데이션 100에서 버퍼 A b (50 m m 인산 나트륨 pH 7.0, 20% 소 프로 파 놀)의 0% 100% 버퍼 A와 isocratic 1 mL/min 흐름에서 elute. 280에서 차입 모니터링 nm. 스 피크에 해당 각 종 하 고 다음 식을 결과 영역을 사용 하 여 통합 하 여 계산.DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2)/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 , trastuzumab(MMAE)2)Trastuzumab(CypK)2 에 대 한 예상된 보존 시간 trastuzumab (CypK, MMAE)은 9.1-9.6 분, 그리고 trastuzumab(MMAE)2 는 10.5 11.0 분 7.5-8.0 분입니다. LC-MS에 의해 공액 분석 Deglycosylate 30 µ L 1 mg/mL ADC 및 비 감소에 수정 되지 않은 항 체의 적어도 6 h 37 ° c.에 대 한 250 PNGase F 단위를 사용 하 여 조건 항 체는 c 4에서 질량 분 서 계에 물에 2% ~ 80% 이기의 20 분 그라디언트를 사용 하 여 1-5 µ m 1.0 x 100 m m 열 elute. 콘 전압 150v의 긍정적인 이온 모드에서 350-4000의 m/z 범위 데이터를 취득. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 원시 데이터 deconvolute 수정 하 고 수정 되지 않은 항 체 질량에서 차이 계산 합니다. 3. 분석 결과 혈 청에서 Trastuzumab(TAMRA)2 Dihydropyridazine 링크의 안정성 무 균 조건 하에서 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 혈 청을 필터링 합니다. 100 단위/mL 페니실린, 및 100 μ g/mL 스를 추가할 수 있습니다. 96 잘 접시의 외부 우물 물으로 채우십시오. 중앙 우물에서 0.1 mg/mL의 최종 농도에 PBS에 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2 의 10 µ L로 필터링 된 혈 청의 triplicate 90 µ L에 혼합. 37 ° C와 4-5% CO2습도 포화 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 5 일, 피펫으로 각 전역 마다 24 시간 잘 철저 하 게 혼합, 5 µ L aliquot, 액체 질소, 플래시 동결과-80 ° c.에 저장 일단 모든 샘플 수집 되어, 해 동이 aliquots 및 분석 간접적인 ELISA를 사용 하 여 이전으로 보고12 일부 수정: 0.25 µ g/mL HER2 4 ° c.에와 하룻밤 96 잘 접시 코트 다른 모든 단계는 상 온에서 수행 됩니다. 다음 날, PBS 0.05% 트윈 (PBS-T)와 5 번을 세척 하 고 1% 소 혈 청 알 부 민 1 h와 차단 합니다. 세척 하 고 2 시간에 대 한 PBS에 1:10000 희석에서 샘플을 품 어. 세척 하 고 안티 TAMRA 항 체 1: 2000 PBS-T h 1에 대 한 0.5 %BSA에서 희석에서 마우스에서 품 어. 세척 하 고 PBS-T h 1에 대 한 0.5 %BSA에서 반대로 마우스 HRP 어원이 1:1000를 품 어. TMB을 추가 하 고 5-10 분 반응 허용. 그래서 50 µ H L2반응 중지 450에서4 1 M과 측정 흡 광도 nm. 570에서 측정 배경 빼기 nm. 표준 희석에 4-매개 변수 로지스틱 회귀 곡선을 적합 하 고 샘플에서 측정을 보간.참고: trastuzumab(MMAE)2 의 안정성 수 부과 상업 ELISA 키트 3.3에서 설명 하는 분석 결과 변경 하 여 동일한 프로토콜을 사용 하 여 ADC의 농도 측정 하. 4. ADC의 세포 독성 평가 참고:이 프로토콜은 이전에 보고 된 분석 실험23,26 일부 수정에 기반. SK-BR-3 및 MCF-7 셀 thaw 고 10% 열 보충 DMEM 비활성화 소 태아 혈 청, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 µ g/mL 스 완전 한 매체를 포함 하는 것은 즉 p25 플라스 크에 정착 하도록 허용. 80-90% 합류 (매 3-4 일) 분석 결과 전에 적어도 2 번에 셀을 분할 합니다. 분석 결과, 이전 2 일 96 잘 접시의 외부 우물 물을 채우십시오. 0.5 m EDTA, 분리기 250g x 3 분 m에서 0.05 %trypsin 리프트 셀 새로운 매체에 resuspend 그리고 3000 셀 (빈) 잘 96 잘 접시에서 당 100 µ L 씨. 셀, 시드 후 2 일 완전 한 매체에서 0.1 %DMSO 3 중에서 모든 샘플의 10 연속 희석을 준비 합니다. 다음 샘플 및 컨트롤을 고려 하십시오: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, trastuzumab 야생 타입, tetrazine vcMMAE, MMAE. 각 잘에서 각 샘플의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C와 4-5% CO2에서 5 일 동안 품 어. 5 일에 세포 생존 능력을 측정 합니다. 이 위해 상업 키트를 사용 하 여 세포를 lyse 발표 ATP 측정을. 0.1 %DMSO 치료 하는 제어 셀 기준 신호 백분율을 플롯 합니다.참고: Adc 혈 청에서 5 일 동안 알을 품을 고 기능 안정성을 증명 하기 위해 세포 독성에 대 한 분석 될 수 있습니다.주의: MMAE은 매우 독성이 있습니다. 따라서 사용 장갑 및 고글 MMAE 파생 상품을 취급 합니다. 사용 하는 경우 수정 되지 않은 MMAE 컨트롤로 실험에서 DMSO에 재고 솔루션을 준비할 때, 증기 두건 안쪽 고체 제품을 처리 합니다.

Representative Results

보고 된 과도 식 시스템 (그림 1a) 22 ± trastuzumab(CypK)2 (그림 1c) 동일한 조건 하에서 생산 하는 야생 타입 항 체의 2/3를 대표 하는 문화 매체의 리터 당 2 밀리 그램을 생성 합니다. 안정적인 셀 라인 31 ± 2mg/L21까지이 수익률을 높일 수 있습니다. Trastuzumab(CypK)2 tetrazine-vcMMAE, 이며 25 ° C (그림 2)에서 3 h 이내 즉 균질 trastuzumab(MMAE)2 와 함께 활용 될 수 있습니다. 이 cytotoxin의 높은 hydrophobicity 10% 이기 때 5의 추가 또는 CypK 당 독 소의 어 금 니 등가물을 더는 데 사용 됩니다. 또는, cycloaddition는 또한 20 h 2 등가물 tetrazine vcMMAE 이기 (그림 2c) 없이를 사용 하 여 내 완료 됩니다. Trastuzumab(CypK)2 tetrazine-25 ° C에서 2 시간 이내 TAMRA 반응 하 고 온도 4 ° C (그림 3c)을 감소 하는 경우 3-6 h는 필요. Trastuzumab(MMAE)2 HPLC hic 측정에 대 한 예상된 DAR은 1.9 (그림 2b). 8.0 분 크로마에서 처음 관찰 된 피크 결합형된 항 체 (DAR 0) 나타내고, 반응이 완료 되 면 완전히 사라진가지고 해야 합니다. 9.1-9.6 분 elutes 고 3 h; 후 지역 90%의 보존 기간. 이동성 변화와 SDS 페이지 젤에 형광 TAMRA (그림 3b)의 설립은 immunoconjugates의 정체와 LC-MS (그림 2d-e 및 그림 3d)에 의해 확인 된다 확인 합니다. 인간의 혈 청 ELISA 후속 분석에서 5 일 동안 trastuzumab(TAMRA)2 의 부 화를 페이로드 (그림 4b) 항 체에 연결 된 남아 확인 합니다. Trastuzumab(MMAE)2 는 SK-BR-3 (높은 HER2) 가슴에 높은 힘 55 ±의 절반 최대한 효과적인 농도 (EC50)와 암 세포, 세포 독성 분석 결과에 대해서 오후 10 시 (그림 4 d). Trastuzumab(MMAE)2 인간의 혈 청 (그림 4c)에서 보육의 5 일 후는 세포 독성을 유지합니다. 반대로, ADC MCF-7 (HER2 낮은) 분석은 EC50 은 200-fold (그림 4 d) 낮은. 야생 유형 항 체, trastuzumab(CypK)2 , tetrazine-vcMMAE MMAE 두 셀 라인 (그림 4e)에서 높은 비 선택적 세포 독성을 표시 하는 반면 (그림 4 d 및 4e), 매우 낮은 독성을 보여줍니다. 그림 1: 과도 식 시스템. A. 과도 transfection HEK293 세포에서 사용 하는 플라스 미드의 관련 지역. CMV: 세포 발기인, WPRE: 마 간염 바이러스 Posttranscriptional 규제 요소, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: 특정 발기인, PylRS: pyrrolysil tRNA 합성, >와 <: 전사의 방향. B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). C. 식 야생 타입 (WT) trastuzumab의 있고 trastuzumab(CypK)2 로 측정 된 서쪽 오 점 단백질 후는 정화 있습니다. 오차 막대는 생물 triplicates의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: tetrazine-vcMMAE와 trastuzumab(CypK)2 의 활용. A. 항 체에서 CypK 잔류물 및 MMAE의 tetrazine 파생 사이 역 전자 수요 Diels 오리 나무 cycloaddition. 반응 그룹은 빨간색으로 강조 표시, p-aminobenzylalcohol 녹색 파란색에서 valine 시트 룰 린 dipeptide 묘사 이다. B. HPLC HIC chromatograms 항 체의 활용의 진행률을 표시. 1.9 다른 시 약 농도 사용 하 여 최대 스 기준 변환의 C. 정도. D-e. 전후에 활용 전체 길이 항 체의 질량 스펙트럼을 deconvoluted. Trastuzumab(CypK)2 는 안정적인 셀 라인을 사용 하 여 얻은 했다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: trastuzumab(CypK)2 tetrazine TAMRA의 활용. A. 항 체에서 CypK 잔류물 사이 TAMRA의 tetrazine 파생 역 전자 수요 Diels 오리 나무 cycloaddition. B. SDS 페이지 젤 기동성 교대 TAMRA의 활용에 의해 발생 하는 젤에 형광을 보여주는. C. 활용 론 2 개의 다른 온도에. D. trastuzumab(TAMRA)의 질량 스펙트럼을 Deconvoluted2. Trastuzumab(CypK)2 는 안정적인 셀 라인을 사용 하 여 얻은 했다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: 혈 청 및 세포 독성 trastuzumab 어원이 같은 말의 안정성. A. internalizing ADC에 원하는 기능을 강조 하는 만화. B. 인간의 혈 청 ELISA에 측정에서 trastuzumab(TAMRA)2 의 안정성. C. 인간의 혈 청 (+ 혈 청, 블랙) 5 일 후에 생존 능력 분석 결과 trastuzumab(MMAE)2 셀. 컨트롤 샘플 혈 청 대신 PBS에서 incubated (-혈 청, 적색) 동일한 분석 결과에 포함 됐다. D. 세포 생존 능력 분석 결과 갓 희석된 항 체 샘플. E. 세포 생존 능력 분석 결과 갓 희석된 MMAE 파생 상품. 오차 막대 3 독립적인 실험의 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 프로토콜에서 설명 하는 trastuzumab(CypK)₂ 를 생산 하기 위해 과도 식 절차 간단 하 고 높은 모듈화에 대 한 수 있습니다. 획득 수익률은 학문 설정²⁷ 에서 예상 하는 것 고 안정적인 셀 라인 추가²¹의 생산 수율 향상을 생성할 수 있습니다. 식, 동안 CypK의 농도가 낮은 5 m m 낮은 ncAA 법인으로 발생할 수 있습니다 보다 더 높은 금액 세포 성장에 영향을 줄 수 있으며 항 체 생산량 감소. CypK 무료 아미노산으로는 낮은 물 가용성, 따라서 그것은 해야 될 처음 녹 0.1 M NaOH에 100 m m이 고 문화 매체에 추가. 매체에서와 셀에 추가 하기 전에 CypK를 diluting, 후 소독 HCl와 필터 매체를 중화에 중대 하다. 그 후, transfection 시 약을 사용 하 여이 프로토콜에 지정 된 이며 제조 업체에서 권장 보육 시간에 따라 높은 항복 식에 대 한 중요 한. 에 대 한 추가 내용은 인간 항 체의 과도 식, 독자가 다른 게시 된 프로토콜³¹^,³²이라고 합니다.

항 체 정화 때 단백질 A 수 지의 높은 초과 전체 항 체 풀 다운은 상쾌한에서 되도록 표시 필요 합니다. 방지 하기 위해 차입 중 trastuzumab의 강수량, 높은 용량, PBS와 즉시 희석 버퍼링 솔루션을 사용 하 여 과도 한 집중을 피하고 버퍼 교환 추천입니다. 항 체를 항상 유지 < 5 mg/mL.

Tetrazine-vcMMAE와 trastuzumab(CypK)₂ 의 활용은 Adc에 대 한 다른 bioorthogonal 핸들을 보고 대부분 반응 보다 빠릅니다. 또한,이 cycladdition 매우 온화한 조건에서 발생 합니다: 실내 온도 또는 낮은 및 생리 적 pH. PBS와 항 체;의 추가 이전 이기와 반응의 DMSO 재고 솔루션을 희석 하는 것이 중요 하다 그렇지 않으면 tetrazine 파생 상품 침전 됩니다. 이기는 MMAE와 TAMRA, 높은 hydrophobicity 때문 에서만 필요 하지만 적은 소수 성 분자의 공동 용 매 추가 필요 하지 않을 수 있습니다. 또는 tetrazine vcMMAE 이기와 단 2 어 금 니의 tetrazine-vcMMAE 20 h 이내 없이 활용 될 수 있습니다. 이 작은 양의 독 소의 ADC 현재 ncAA 기반 기술에 비해 제조 비용에서 상당한 감소를 포함할 수 있었다. Trastuzumab(CypK)₂ 는 4 ° c.에 보존 하는 때 적어도 4 개월 동안 완전히 반응

HPLC HIC MMAE 매우 소수 이며, 0, 1 및 2 독 항 체 어원이 같은 말에 해당 하는 봉우리의 뛰어난 해상도 제공 합니다 이후 다 르의 정확한 결정을 수 있습니다. Unreacted tetrazine-vcMMAE 13.7 분 약을 elutes 고 280에서 감지 되 면 nm. 이 기술은 높은 순수성을 가진 시작 물자를 요구 한다. 또한, 그것 때문에 그들은 보존 시간과 봉우리의 모양을 변경할 수 있는 BCN-오 등 다른 tetrazine-반응성 분자와 반응을 풀기 위해 추천 되지 않습니다. 그것은 샘플의 소금 농도 맞는 모바일 단계에 하나 그라데이션의 시작에 좋은 분리를 얻기 위하여 10-20 µ L 주입 하는 경우에 특히 중요.

LC MS 분석에 대 한 항 체 샘플의 deglycosylation는 원시 스펙트럼의 deconvolution 시 단일 피크를 얻을 필요 합니다. 총 항 체와 ADC의 정확도 악기의 callibration에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 수정에 대 한 질량을 계산 하기 위해 ADC에 대 한 얻은 것에서 수정 되지 않은 항 체에 대 한 얻은 질량을 뺍니다. 현대 고해상도 질량 분석기는 1:10000 아래 상대적 오류를 제공 해야 합니다. LC MS 다른 종 사이의 비율을 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다, 있지만이 값은 일반적으로과 수정 생성 된 종의 이온화 용량에 영향을 미칠 수 있기 때문에 낮은 양의 불순물 감지 되지 않을 수 있습니다.

약물의 조기 출시 높은 독성과 낮은 효능;에서 발생 하기 때문에 Adc에서 링커의 안정성은 중요 한 무료 cytotoxin 건강 한 조직을 손상 하 고 벌 거 벗은 항 체 병 셀에 대상 바인딩 사이트에 대 한 무장 한 경쟁 한다. 안정성 분석 결과의 가변성은, 5% 아래 릴리스 예상 되어야 한다.

마지막으로,와 같은 trastuzumab(MMAE)₂ SK-BR-3 셀 (HER2 높은)에서 세포 독성을 비교 하 여 평가 될 수 있습니다 후자의 이후 MCF-7 세포 (낮은 HER2) 표현 전^{28 보다 적은 15 HER2 수용 체 HER2를 표적으로 하는 ADC의 선택도}. immunoconjugate 2 배나 SK-BR-3 MCF-7에 비해 낮은 세포 생존 능력으로 발생 하는 것으로 예상 된다. SK-BR-3에서 EC₅₀ 이 ADC²⁹^,³⁰의 높은 힘을 반영 하는 두 자리 nanomolar 범위에 있어야 합니다. 수정 되지 않은 항 체 trastuzumab(MMAE)₂ 또는 trastuzumab,이 분석 결과에 아무 독성을 표시 해야 합니다. Tetrazine-vcMMAE peptidomimetic 독 소의 활동을 제거 하는 링커 이후는 효과가 3 배나 ADC 보다 낮은 있어야 합니다. 반대로, MMAE 세포 막³⁰침투를 수 있기 때문에, 그것은 야 ADC에 유사한 독성 하지만 HER2 높은 HER2 낮은 셀 라인 사이 차별 표시. 또한,이 분석 결과 혈 청에서 ADC의 5 일 배양 후 수행 하는 경우 사용할 수 있습니다 링커의 안정성의 기능 증거를 제공 하기: 릴리스 독 소의 결과 중에 SK-BR-3에서 ADC 효율 감소 MMAE p로 릴리스 되었습니다 하는 경우 링커 또는 링커 traceless 방식에서 죽 습 했다 경우 선택도 감소의 예술.

여기에 설명 된 ADC 기술 IgG1s에 신의 cyclopropene 파생의 효율적이 고 사이트 설립이 있습니다. 손쉬운 정화 다음 항 체 빠르게 tetrazine 포함 된 분자로, 동종 제품 저조한 활용 될 수 있습니다. 작은 크기 및 cyclopropene 최소 핸들의 높은 반응성 때문에이 방법은 sterically 방해 페이로드의 활용을 사용 해야 합니다. 결과 immunoconjugates은 혈 청에서 안정 되며 매우 강력 하 고 선택. 전반적으로, CypK 항 체 및 치료 또는 진단에 사용 될 다른 단백질 어원이 같은 말, 사이트별 빠르고 안정적인 bioorthogonal 결합을 수 있습니다.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 영국 의료 연구 위원회에 의해 지원 되었다. 사운드 미 EMBO 친교 (ATLF 158-2016)를 보유 하 고 헤 펠 럼 및 지원, jw 메리어트 턱 및 G. 김, C. W. 모건과 O. Perisic 도움과 조언을 위해 감사.

Materials

Expi293F	ThermoFisher Scientific	A14527	HEK suspension cells
Expi293 Expression Medium	ThermoFisher Scientific	A1435101	Expression medium
Antibiotic-antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062	Penicillin-streptomycin-amphotericin B
125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap	Corning	431143	Shake flasks
Brunswick S41i incubator	Eppendorf	S41I230011	CO2 incubator with a shaker
Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution	VWR	191373M
Cyclopropene lysine	Sichem	SC-8017	In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014
Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated	Merck Millipore	SCGP00525
Opti-MEM, Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985070	Reduced serum medium
ExpiFectamine 293 Transfection Kit	ThermoFisher Scientific	A14525	Transfection reagent
5810 R centrifuge	Eppendorf	5811000460
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized	Merck Millipore	SLGP033RS
Protein A resin	Sino Biological	10600-P07E-RN-25
Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50	Bio-Rad	7311550	Polypropylene chromatography column
Econo-Column Funnel	Bio-Rad	7310003
Sodium citrate	Fluka	71635
ÄKTA explorer FPLC	GE Healthcare
HiTrap HIC Selection Kit	GE Healthcare	28-4110-07	Includes HiTrap 1 mL Butyl HP
Ammonium sulfate	VWR	2133.296
Isopropanol	Honywell	34863-2.5L
Dymethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
Tetrazine-vcMMAE	ChemPartner	–	Costum synthesized
Tetrazine-5-TAMRA	Jena Bioscience	CLK-017-05
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well	ThermoFisherScientific	NP0321BOX
Xcell SureLock Mini-Cell	ThermoFisherScientific	EI0001
UltiMate 3000 HPLC	ThermoFisherScientific
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm	ThermoFisherScientific	088553
PNGase F	New England BioLabs	P0704S
NanoAcquity	Waters
C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column	Waters
96-well microplates for cell culture	ThermoFisherScientific	156545
Human serum	Sigma-Aldrich	H4522-20mL
CO2 incubator	Panasonic
HER2 ECD	Sino Biological	10004-HCCH
Anti-TAMRA	Abcam	an171120
Anti-mouse HRP	Santa Cruz	sc-2005
TMB	BioLengend	421101
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	84727-500ML
PHERAstar FS	BMG Labtech		Plate reader
DMEM	Sigma-Aldrich	D5671-500ML
SK-BR-3	ATCC	HTB-30
MCF-7	ATCC	HTB-22
CellTiterGlo 2.0 Assay	Promega	G9242	Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence.
Monomethyl Auristatin E	Cayman Chemical	16267
NanoDrop 2000	ThermoFisherScientific		Microvolume spectrophotometer
Human IgG ELISA Quantificaiton Set	Bethyl	E80-104
MaxEnt1 in MassLynx	Waters		Software application for mass spectrum deconvolution
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay)	Epitope Diagnostics, Inc.	KTR 782
Tube 50 mL, 114x28mm, PP	Sarstedt	62.547.254	Conical tube
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL	Merck	UFC905024	Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL	Merck	UFC805024	Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification)
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	ThermoFisherScientific	89882	Size exclusion spin columns
Tube PCR 0.2ml Flat Cap	Thistle Scientific Ltd	AX-PCR-02-C-CS	PCR tubes
Nunc MaxiSorpª flat-bottom	ThermoFisherScientific	44-2404-21	Plates for ELISA

Referências

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Citar este artigo

Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. J. Vis. Exp. (139), e58066, doi:10.3791/58066 (2018).