高速 Bioorthogonal 反応により抱合体の新世代抗体医薬の非標準アミノ酸の遺伝的符号化

1. 生産し、抗体の特徴 抗体を表現します。 100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン 250 ng/mL アムホテリシン B. 維持で 8% CO2で 37 ° C でセル加湿搭載インキュベーターと式培の 50 mL を含む 250 mL フラスコに HEK 懸濁細胞のバイアルを解凍します。125 回転でシェーカー。株の前に少なくとも 2 回 0.3 0.5 x 106セル/mL (2-3 日ごと) にセルを分割します。 2.5 x 106セル/ml の密度は達された (2-3 日分割後)、準備 100 mM CypK の新鮮なソリューション。このため、CypK の 64 mg の重量を量る、すべて解けてない粒子を回復し、超音波照射下 0.1 の水酸化ナトリウム、渦、スピンの 2.5 mL を追加します。 抗生物質を添加した表現媒体の 42.5 ml 2.5 mL CypK (0.1 M NaOH で 100 mM) を追加します。よく混ぜる 0.1 M HCl の 250 μ L を追加し、0.22 μ m フィルターを使用して殺菌します。 低血清培地で 2.5 mL に HC と LC の pKym1 プラスミド21の 50 μ g を希釈します。別のチューブで減少血清培地で 2.5 mL トランスフェクション試薬の 135 μ L を希釈します。 ソリューションを準備した後 5 分ミックス プラスミッドとトランスフェクション試薬溶液と DNA とトランスフェクション試薬間複合体の形成を許可する 20 分間インキュベートします。 一方で、500 × g で 5 分間ターゲット密度で 1 億 2500 万の細胞を遠心、CypK を含む表現媒体で再懸濁します、DNA-トランスフェクション試薬の混合物を追加します。CypK は、購入または報告以前18を合成できます。 20 h のための細胞を培養後、トランスフェクション試薬エンハンサー キットに付属の 250 μ L を追加します。 CypK (培地交換は不要です式中) の付加の後の上清の 6-7 日から抗体を収穫します。* またより高いより一貫した収量を得るためには、安定したセルライン生成できますオラー サルビアらで説明されているよう201821。この場合、trastuzumab(CypK)2は、単に式中 CypK 5 mM の追加によって表されます。 抗体を浄化します。 3000 × g で 15 分間細胞を遠心します。 0.45 または 0.22 μ m フィルターで上清をフィルター処理します。フィルターが隠蔽され、新しいものに交換してフィルタ リングを続行します。後数ミリリットルのみ場合は、遠心分離機の 7000 x g でさらに 15 分間清。 空ポリプロピレン カラムで蛋白質 A 樹脂 (上澄みの 2 mL/100 mL) を追加し、ビーズ洗浄バッファー (0.1 M リン酸ナトリウム、150 mM の NaCl) の少なくとも 5 冊と樹脂を平衡します。 2 つの 50 mL の円錐管に上清を分割し、続いて事前釣合い蛋白質 A 樹脂ビーズ洗浄バッファー (0.5 M リン酸ナトリウム、150 mM の NaCl) × 5 を追加します。清抗体をプルダウンする室温で 3 h のローラーの円錐形の管を配置します。また: 推奨の樹脂量の少なくとも 2 倍の列で上清を追加し、通過できるようにします。、SDS-PAGE により上清に残っている抗体の有意な量ではないことを確認します。ある場合は、もう一度、樹脂を通して清を溶出します。 列に上清タンパク質 A 樹脂を転送し、液体を許可を通過します。 洗浄バッファー (または少なくとも 10 樹脂ボリューム) の 25 の mL を追加し、通過できるようにします。、 4 ml の 0.1 M クエン酸ナトリウム、pH 3、1 mL の 1 M リン酸バッファー、150 mM の NaCl の抗体を溶出します。 10 ml の PBS の抗体を希釈、0.5 – 1 集中 mL 遠心ろ過および PBS で 3 回交換バッファー。 FPLC 0.5 mL/min と 0-100 の流ブチル HIC 列の使用によってサンプルを浄化高塩バッファー内低塩バッファー (50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0, 20% イソプロパノール) の 30 分の % 勾配 (1.5 M (NH4)2SO4、50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0、5% イソプロパノール)。すべての画分を収集し、280 で溶出を監視 nm。少量 (< 1 mg) は、収量、純度を最大限に 2.4 で説明されている条件の下で高速液体クロマトグラフィー HIC で浄化することが。 抗体を含む、PBS で少なくとも 4 mL に希釈し、PBS で 3 回遠心ろ過と交換バッファーによってそれらを集中した分数をプールします。 抗体を定量化します。 280 で吸光度を測定することによりおおよその濃度を取得 nm マイクロ ボリューム分光光度計を使用しています。 正確な測定が必要な場合は、人間の Igg を測定する ELISA キットを使用します。大まかな見積もりのとおり Coomassie ベースの汚れで SDS-PAGE を使用してください。 1 mg/mL で elisa 法による定量化トラスツズマブ標準 2 倍 6 倍希釈することによって基準を準備します。 基準と読み込みバッファーを減らすに約 0.25 mg/mL で試料を沸騰します。 4-12% ビス トリス SDS-PAGE を使用してそれらを実行 MES SDS バッファーと Coomassie ベースの染料で染色します。最後に光や ImageJ を用いた重鎖に対応するバンドの色の濃さを測定し、標準曲線のサンプルからの信号を補間します。 4 ° C で抗体を保存します。 2. 抗体の共役し、ADC を特徴付ける Tetrazine ベアリング分子と抗体を共役します。 20 μ L のアセトニ トリルと小さな円錐管 (例えば、PCR チューブ) に 76 μ L の PBS の tetrazine vcMMAE (4 μ L、ジメチルスルホキシド (DMSO) で 3.4 mM) 10 モル同等を希釈します。 Trastuzumab(CypK)2 (100 μ L, PBS で 2 mg/mL) の 1 モル当量を加えて混和, 3 h trastuzumab(MMAE)2を形成する室温 (25 ° C) で反応することができます。注: tetrazine 5-耽羅など他の分子は、このプロトコルを使用して tetrazine vcMMAE ではなく抗体にリンクできます。 ADC を浄化します。 製造元の指示に従って PBS で、サイズ排除カラムを平衡事前。 回転カラムと 1500 × g で 1 分間遠心に反応の全体のボリュームを追加します。 ADC を定量化し、SDS-PAGE による共役を分析 1.3.2 で説明するように ADC を定量化します。SDS ページの軽鎖の色の濃さを測定することにより標準曲線の非修飾抗体を使用します。 重鎖は、活用に分子量の増加を示す少しシフトしている必要があります。注: trastuzumab(TAMRA)2のように蛍光体に抗体を変更した場合は、染色する前にゲルの蛍光が重鎖に対応するバンドだけで表示されます。 高速液体クロマトグラフィー HIC によって共役を分析します。 100% のバッファー A と高速液体クロマトグラフィー HIC コラムを平衡させ (1.5 M (NH4)2SO4、50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0, 5% イソプロパノール) 5 分。 トラスツズマブ (CypK) 2 2 倍の 15 μ L での mg/ml 1 つ解決のミックス 15 μ L (67 pmol) は、バイアルのをバッファーします。HPLC で 10 μ L 注入をプログラムします。 続く 15 分勾配 B (50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0, 20% イソプロパノール) のバッファー A の 0 0 から 1 分 100% のバッファー A のイソクラティック 1 mL/分フローで溶出します。280 で溶出を監視 nm。 それぞれの種に対応するピークと次の式の結果の領域を使用して統合することにより、DAR を計算します。DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2)/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)Trastuzumab(CypK)2の予想される保存期間は 7.5 8.0 分、トラスツズマブ (CypK、MMAE) は 9.1 9.6 分、trastuzumab(MMAE)2は 10.5 11.0 分。 LCMS による共役を分析します。 1 mg/mL ADC と非還元で非修飾抗体 Deglycosylate 30 μ L 37 ° C で少なくとも 6 時間 250 PNGase F ユニットを使用しての条件 水で 2 ~ 80% アセトニ トリル 20 分勾配を使用して 1-5 μ m 1.0 x 100 mm 列 C4 で質量分析計に抗体を溶出します。M/z 範囲は正イオン モードで 350-4000 コーン電圧 150 v のデータを取得します。 Raw データの適切なソフトウェアを使用してようになりました。修正と変更されていない抗体質量の差を計算します。 3 Trastuzumab(TAMRA)2血清中の Dihydropyridazine のリンケージの測定安定性 無菌条件下で 0.22 μ m のフィルターを使用して血清をフィルター処理します。100 単位/ml ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシンを追加できます。 水で 96 ウェル プレートの外部井戸を埋めます。中央の井戸に最終濃度 0.1 mg/mL の PBS で 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2の 10 μ L でフィルター処理された血清の帳票の 90 μ L でミックスします。37 ° C と 4-5% CO2で湿度と飽和インキュベーターにプレートを配置します。 ピペットの各 5 日間にわたってすべての 24 h も徹底的にミックス、5 μ L を分注、取る、液体窒素で急速凍結し-80 ° C で保存 すべてのサンプルが収集されると、因数を解凍し、いくつかの変更と以前に報告された12として間接 elisa 法を用いた分析します。 4 ° C で 0.25 μ g/mL HER2 と一晩 96 ウェル プレートをコートします。他のすべての手順は、室温で実行されます。 次の日に PBS 0.05% トゥイーン (PBS-T) で 5 回を洗って、1 時間 1% ウシ血清アルブミンをブロックします。 洗って 2 時間 PBS の 1:10000 の希釈サンプルをインキュベートします。 洗って、1 時間 0.5 %bsa を PBS T の配分希釈でマウスで発生した反耽羅抗体を孵化させなさい。 洗浄し、抗マウス HRP 共役 1: 1000 1 時間 0.5 %bsa を PBS T で孵化させなさい。 TMB を追加し、5-10 分に反応できるようにします。 50 μ L H2と反応、その停止4の 1 M とメジャーの吸光度 450 nm。570 で測定したバック グラウンド減算 nm。 標準的な希薄を 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰曲線に当てはめるし、サンプルから測定値を補間します。注: trastuzumab(MMAE)2の安定性は、ADC の濃度を測定する市販 ELISA キットの 3.3 で説明されているアッセイを変更することで同じプロトコルを使用して評価できます。 4. ADC の細胞毒性を評価します。 注: このプロトコルは、いくつかの変更と以前に報告されたアッセイ23,26に基づいています。 SK BR 3 および mcf-7 細胞を解凍し、10% 熱 DMEM は 100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 単位/ml ペニシリン、ウシ胎児血清を不活化すなわち完全培地を含む p25 フラスコに落ち着くことができます。 アッセイの前に少なくとも 2 回の 80-90% 合流 (すべての 3-4 日) でセルを分割します。 2 日前のアッセイは、水で 96 ウェル プレートの外側の井戸を埋めます。その後 0.5 ミリメートルの EDTA、遠心分離機 250 x g で 3 分で 0.05% トリプシン リフト セルは新しい媒体で再懸濁します、96 ウェル プレートでの (空の) ウェルあたり 100 μ L で 3000 の細胞を播きます。 細胞を播種後 2 日間は、完全培地に 0.1 %dmso を 3 通すべてのサンプルの 10 のシリアル希薄を準備します。以下のサンプルとコントロールを考慮する: trastuzumab(MMAE)2trastuzumab(CypK)2、トラスツズマブ野生型、tetrazine vcMMAE、MMAE。 各ウェルに 100 μ L の各サンプルを追加し、37 ° C および 4-5% CO2で 5 日間インキュベートします。 5 日目、細胞生存率を測定します。この目的のためには、細胞を溶解し、ATP 放出を測定する市販キットを使用します。0.1 %dmso 処理制御の細胞に対する信号の割合をプロットします。注: Adc が血清で 5 日間培養、機能の安定性を証明するために細胞毒性の試金。注意: MMAE は非常に有毒です。したがって MMAE 誘導体を処理するときの手袋とゴーグルを使用します。あなたの実験でのコントロールとしてそのまま MMAE を使用すると DMSO で原液を準備するときに場合、は、ヒューム フード内部固体製品を扱います。