Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Monócitos, neutrófilos e células dendríticas (DCs) são células mieloides que surgem a partir de progenitores hematopoiéticos, principalmente na medula óssea, por um processo chamado myelopoiesis. Comuns progenitores mieloides (CMPs) têm potencial para produzir células mieloides, bem como megacariócitos e eritrócitos, mas células não linfoides. Progenitores de granulócitos-monócitos (GMPs), que são derivados da CMPs, produção de granulócitos e monócitos, mas perderam megacariócito e potencial de eritrócitos. Monócitos e clássica e plasmocitoide DCs (conjuntos/PDC) também são pensados para surgir a partir de progenitores comuns conhecidas como progenitores de monócitos-DC (MDPs), que são produzidas pelos CMPs. Gradual restrição do potencial de linhagem em última análise, resulta em linhagem confirmada progenitores: progenitores de granulócitos, progenitores de monócitos e progenitores de células dendríticas (Figura 1).

Weissman e colegas relataram que o CMPs são encontrados no Lin^– c-Kit⁺ Sca-1^– CD34 (LKS^–)⁺ FcγR^Eis fração da medula óssea de rato, enquanto GMPs constam o CD34 LKS^{– +} FcγR ^Oi fração¹. No entanto, estas frações “CMP” e “GMP” são muito heterogêneas. Por exemplo, a fração “GMP” também contém progenitores confirmada linhagem granulócitos e monócitos progenitores^1,2. MDPs separadamente foram relatados para ser CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ progenitores que também expressam CD34 e FcγR^3,4. MDPs dão origem a cDC/pDC-produzindo comum DC progenitores (CDPs), que têm sido relatados para expressar níveis mais baixos de c-Kit (CD117) e não estão incluídos na fração LKS^{– 5}.

Supunha-se anteriormente que os monócitos surgirem através de um caminho único (CMP-GMP-MDP-monócitos). Consistente com este modelo, confirmada por monócitos progenitores produzido pela PGM (chamado progenitores de monócitos, MPs)² e MDPs (chamadas comum progenitores de monócitos, cMoPs)⁶ parecem ser as mesmas células com base na expressão do marcador de superfície compartilhada . No entanto, recentemente demonstrou que os monócitos são produzidos de forma independente por GMPs e MDPs e foram capazes de distinguir entre MPs e cMoPs pela única célula de sequenciamento de RNA⁷.

Recentemente, nós modificamos o Weissman “CMP” e estratégia associada “GMP” para identificar 6 subfractions de C57BL/6J medula óssea de rato contendo diferentes oligopotentes e confirmada por linhagem mieloide progenitor subconjuntos. Primeiro, informou que a mancha para Ly6C e CD115 permite o isolamento de GMPs oligopotentes, bem como progenitores de colônias de granulócitos (GPs) e progenitores monócito (MPs e cMoPs, que não conseguimos separar) do “GMP” fração² (LKS ^– CD34⁺ FcγR^Oi portão; A Figura 1). Posteriormente demonstrámos que MDPs são encontrados predominantemente na fração “CMP” (CD34 LKS^{– +} FcγR^o portão), que também contém Flt3⁺ CD115^lo e Flt3^– subconjuntos⁷ (Figura 1 ). O CMP-Flt3^{+ Eis} CD115 fração produz tanto GMPs e MDPs mediante transferência adotiva. O subconjunto de CMP-Flt3^– contém progenitores que parecem ser os intermediários entre^o CMP-Flt3⁺ CD115 células e PGM. Ao contrário de MDPs, tanto o CMP-Flt3⁺ CD115^Eis e frações CMP-Flt3^– também possuem megacariócito e eritrócitos potenciais.

É importante observar, no entanto, que é atualmente incerto se as frações “CMP” contêm progenitores que verdadeiramente são oligopotentes (por exemplo, células individuais dentro da CMP-Flt3^{+ Eis} CD115 fração que possuem neutrófilos, monócitos, DC, megacariócito e potencial de eritrócitos), ou alternativamente, compreendem uma mistura de progenitores com potencial de linhagem mais restrita. Formadoras de ensaios (culturas de metilcelulose) revelaram células com (neutrófilos) granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócito potencial (células GEMM) na “CMP”, CMP-Flt3⁺ CD115^Eis e frações CMP-Flt3^{– 1 ,7}, mas não permitem a avaliação do potencial de DC. Em contraste, formadoras de ensaios demonstraram a existência de oligopotentes GMPs (progenitores com neutrófilos e monócitos potencial) no “GMP” fração^1,2, e isto é suportado pelo recente unicelulares análise de transcriptomic⁸. Não atualmente se sabe, no entanto, se essas GMPs oligopotentes também produzem outros granulócitos (eosinófilos, basófilos e mastócitos).

Baseado nestes estudos, agora demonstraremos como 7 superfície marcadores (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C e CD115) pode ser usado para identificar e isolar estes 6 subconjuntos de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores. O protocolo descrito aqui pode ser aplicado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo transferência adotiva as experiências em ratos e análise molecular (sequenciamento de RNA em massa e de célula única, mancha ocidental, etc.).

O protocolo consiste em 3 fases: 1) preparação de uma suspensão de célula da medula óssea de células, 2) enriquecimento de progenitores hematopoiéticos (classificação magnética-ativado da pilha) e 3) a identificação e isolamento, se desejado, de subconjuntos de progenitor pelo fluxo cytometry (usando um analisador ou um classificador, conforme o caso). O primeiro passo é o isolamento de células de medula óssea de fêmures e tíbias de ratos sacrificados e é similar a outros protocolos descritos anteriormente,⁹. Em seguida, a amostra é enriquecida por células estaminais e progenitoras usando um coquetel de anticorpos contra marcadores de superfície celular de eritrócitos, neutrófilos, monócitos, linfócitos, etc., para esgotar as células diferenciadas. Isto não é obrigatório, mas fortemente recomendado para otimizar a deteção de subconjuntos do progenitor e reduzir a quantidade de anticorpos necessários para a identificação de progenitor e o tempo necessário para citometria de fluxo. O protocolo de esgotamento de linhagem abaixo descreve Magnetic-Activated célula classificação (MACS) usando um Mouse linhagem celular depleção Kit (que contém anticorpos biotinilado contra CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 e Ter-119, além de anti-biotina microbeads) e um separador magnético automatizado. A etapa final é a identificação (e classificação, se desejado) de subconjuntos do progenitor por citometria de fluxo. O painel de anticorpos descritos abaixo (Veja também a tabela 1) foi concebido para ser usado em um citômetro de fluxo (analisador ou classificador) com 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Figura 1: neutrófilos, monócitos e DC progenitores e vias de diferenciação. O modelo recentemente revisado de myelopoiesis⁷ é ilustrado, com os portões de Weissman para “CMPs” (azuis) e “PGM” (verde)¹ sobrepostos. Esta figura foi modificada de Yáñez et al . 2017⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.