Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Monocyten, neutrofielen en dendritische cellen (DC’s) zijn myeloïde cellen die uit hematopoietische progenitorcellen, voornamelijk in het beenmerg, door een proces genaamd myelopoiesis voortvloeien. Gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMPs) hebben het potentieel om te produceren myeloïde cellen, evenals megakaryocytes en erytrocyten, maar niet lymfoïde cellen. Granulocyt-monocyt progenitoren (GGP’s), die zijn afgeleid van CMPs, produceren granulocyten en monocyten, maar Megakaryocyt en erytrocyt potentiële hebben verloren. Monocyten en klassieke en plasmacytoid DCs (cDCs/PDC’s) wordt ook gedacht dat ze voortvloeien uit gemeenschappelijk progenitoren bekend als monocyt-DC progenitoren (MDP’s), die worden geproduceerd door CMPs. geleidelijke beperking van de bloedlijn potentieel uiteindelijk in de bloedlijn-gepleegd resulteert progenitoren: granulocyt progenitorcellen, monocyt progenitoren en dendritische cel progenitoren (Figuur 1).

Weissman en collega’s gemeld dat CMPs zijn gevonden in de Lin^– c-Kit⁺ Sca-1^– (LKS^–) CD34⁺ FcγR^lo Fractie van muis beenmerg, terwijl GGP’s zijn opgenomen in de LKS^– -CD34⁺ FcγR ^Hallo breuk¹. Deze “CMP” en “GMP” breuken zijn echter zeer heterogeen. Bijvoorbeeld, bevat de “GMP” breuk ook lineage-begaan granulocyt progenitoren en monocyt progenitoren^1,2. MDP’s gemeld afzonderlijk te worden CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ progenitoren die ook uitdrukking geven aan CD34 en FcγR^3,4. MDP’s aanleiding geven tot cDC/pDC-producerende gemeenschappelijk DC progenitoren (CDP’s), die zijn gemeld bij het uiten van lagere niveaus van c-Kit (CD117) en zijn niet opgenomen in de LKS^– deel⁵.

Eerder werd aangenomen dat de monocyten ontstaan via een enkel traject (CMP-GMP-MDP-monocyt). Overeenstemming is met dit model, monocyt-begaan progenitoren geproduceerd door GGP’s (genaamd monocyt progenitorcellen, MPs)² en MDP’s (genoemd gemeenschappelijk monocyt progenitorcellen, cMoPs)⁶ lijken te zijn dezelfde cellen op basis van gedeelde oppervlakte marker expressie . Echter we onlangs aangetoond dat monocyten onafhankelijk worden geproduceerd door GGP’s en MDP’s, en waren in staat om onderscheid te maken tussen MPs en cMoPs door eencellige RNA sequencing⁷.

We hebben onlangs gewijzigd de Weissman “CMP” en de “GMP” gating strategie ter identificatie van de 6 subfractions van C57BL/6J muis beenmerg met verschillende oligopotent en geslacht-begaan myeloïde voorlopercellen deelverzamelingen. We eerst gemeld dat kleuring voor Ly6C en CD115 het isolement van oligopotent GGP’s, evenals granulocyt progenitoren (GPs) en monocyt progenitoren (zowel MPs als cMoPs, die wij op dit moment niet te scheiden) vergunningen van de “GMP” breuk² (LKS ^– CD34⁺ FcγR^Hallo poort; Figuur 1). Wij vervolgens aangetoond dat MDP’s voornamelijk te in de “CMP” breuk vinden zijn (LKS^– CD34⁺ FcγR^lo gate), waarin ook Flt3⁺ CD115^lo en Flt3^– deelverzamelingen⁷ (Figuur 1 ). De CMP-Flt3⁺ CD115^lo breuk levert zowel GGP’s en MDP’s bij adoptief overdracht. De CMP-Flt3^– -subset bevat progenitoren die lijken te zijn van tussenproducten tussen CMP-Flt3⁺ CD115^lo cellen en GGP’s. In tegenstelling tot MDP’s, zowel de CMP-Flt3⁺ CD115^lo en CMP-Flt3^– fracties ook beschikken over Megakaryocyt en erytrocyt potentiële.

Het is belangrijk op te merken echter dat er op dit moment onduidelijk of de fracties “CMP” progenitoren die echt zijn oligopotent (bijvoorbeeld individuele cellen binnen de CMP-Flt3⁺ CD115^lo breuk die neutrofiele bezitten, bevatten monocyt, DC, Megakaryocyt en erytrocyt potentiële), of als alternatief, bestaan uit een mengsel van progenitoren met beperktere lineage potentieel. Kolonievormende assays (methylcellulose culturen) geopenbaard cellen met granulocyt (neutrofiele), erytrocyt, monocyt en Megakaryocyt potentiële (GEMM cellen) in de “CMP”, CMP-Flt3⁺ CD115^lo en breuken van de CMP-Flt3^{– 1 ,7}, maar niet mogelijk is de evaluatie van DC kansen. In tegenstelling, kolonievormende testen aangetoond dat het bestaan van oligopotent GGP’s (progenitoren met neutrofiele én monocyt potentiële) in de “GMP” breuk^1,2, en dit wordt ondersteund door recente eencellige Transcriptomic analyse⁸. Het is niet momenteel bekend, echter of deze oligopotent GGP’s ook andere granulocyten (eosinofielen, basofielen en mast cellen produceren).

Op basis van deze studies, we laten nu zien kunnen hoe 7 oppervlakte markeringen (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C en CD115) worden gebruikt om te identificeren en deze 6 deelverzamelingen van oligopotent en myeloïde voorlopercellen lineage-begaan te isoleren. Het protocol hier beschreven kan worden toegepast voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten in muizen en moleculaire analyse (bulk en eencellige RNA sequencing, westelijke bevlekken, etc.).

Het protocol bestaat uit 3 fasen: 1) voorbereiding van een enkele celsuspensie van beenmerg cellen, 2) verrijking voor hematopoietische progenitorcellen (magnetische-geactiveerde cel Sorteren), en 3) identificatie en isolatie, indien gewenst, van voorlopercellen deelverzamelingen door stroom Cytometry (met een analyzer of een sorteerder, voorkomend). De eerste stap is het isolement van beenmergcellen van het dijbeen en zijn verbeend euthanized muizen en is vergelijkbaar met andere eerder beschreven protocollen⁹. Vervolgens wordt het monster verrijkt voor stuurpen en voorlopercellen cellen met behulp van een cocktail van antilichamen tegen cel oppervlakte markers van erytrocyten, neutrofiele granulocyten, monocyten, lymfocyten, enz., tot het afbreken van de gedifferentieerde cellen. Dit is niet verplicht, maar sterk aanbevolen voor het optimaliseren van de detectie van de deelverzamelingen van voorlopercellen, en aan het verminderen van de hoeveelheid antilichamen nodig voor identificatie van voorlopercellen en de tijd die nodig is voor de stroom cytometry. Het geslacht uitputting protocol hieronder beschrijft Magnetic-Activated cel sorteren (MACS) met behulp van een muis Lineage cel uitputting Kit (waarin biotinyleerd antilichamen tegen CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, en Ter-119, plus anti-Biotine microbeads) en een geautomatiseerde magnetische scheidingsteken. De laatste stap is de identificatie (en sorteren, indien gewenst) van de voorvader deelverzamelingen door stroom cytometry. Het antilichaam paneel hieronder beschreven (Zie ook tabel 1) is ontwikkeld om te worden gebruikt in een flow cytometer (analyzer of diasorteerderweergave) met 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Figuur 1: neutrofiele, monocyt en DC progenitoren en differentiatie trajecten. De onlangs herziene model van myelopoiesis⁷ is geïllustreerd, met de Weissman-poorten voor “CMPs” (blauw) en “GGP’s” (groen)¹ bedekt. Dit cijfer is gewijzigd van Yáñez et al. 2017⁷. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.