Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Tausende von somatischen Mutationen, die im Zusammenhang mit Krebsentstehung wurden berichtet¹. Unter diesen sind einige prädiktive Marker für die Wirksamkeit der gezielten Therapie ^2,3 und genetisches screening dieser Mutationen ist jetzt klinischen Routine. Tröpfchen-Digitaltechnik-PCR (DdPCR) verwendet werden, um das Vorhandensein oder das Fehlen von Mutationen mit hoher Erkennungsgenauigkeit zu überwachen und ist sehr kompatibel mit nicht-invasiven flüssigen Biopsien^4,5. Aktuelle DdPCR Assays sind jedoch in erster Linie Mutationen bekannt a-priorizu erkennen. Dies schränkt die Verwendung von DdPCR als ein Discovery-Tool die Mutation ist nicht bekannt. In der Tat konkurriert in der konventionellen DdPCR Design, eine Hydrolyse-Sonde erkennt das Wildtyp Allel (WT-Sonde) mit einer speziellen Sonde erkennen die mutierten Allels (MUT-Sonde) (Abbildung 1A). Sonde mit höherer Affinität zur Vorlage hybridisiert und veröffentlicht seine Fluorophor, unter Angabe der Art des entsprechenden Allels. Die Fluoreszenz Daten für jedes Tröpfchen können in einem Streudiagramm repräsentieren die Fluoreszenz emittiert durch den WT und MUT Sonden in verschiedenen Dimensionen visualisiert werden. Eine schematische Darstellung der ein typisches Ergebnis für einen herkömmlichen DdPCR-Assay ist in Figur 1Apräsentiert. In diesem Beispiel entspricht die Blaue Wolke Tröpfchen mit WT Allele identifiziert durch die WT-Sonde, während die rote Wolke Tröpfchen entspricht in der MUT-Allel verstärkt und durch die MUT-Sonde identifiziert. Abhängig von der Menge der DNA in der Reaktion geladen können doppelte positive Tröpfchen mit WT und MUT Amplifikate (grüne Wolke) angezeigt werden. Die helle graue Wolke entspricht leer Tröpfchen.

Da die meisten Plattformen für den Nachweis von einer begrenzten Anzahl von Fluorophore (in der Regel 2, aber bis zu 5) ermöglichen, ist Durchsatz von konventionellen DdPCR begrenzt. Daher erfordert die Ausrichtung auf Regionen mit mehreren angrenzenden Mutationen Design von technisch anspruchsvollen multiplex DdPCR Assays oder die Verwendung von mehreren Reaktionen auf jede Mutation parallel. Die Drop-off-DdPCR-Strategie, überwindet diese Einschränkung, da es möglicherweise genetische Veränderung innerhalb einer Zielregion mit einer einzigartigen WT Hydrolyse Sonden erkennen kann. Die erste Sonde (Sonde 1) Abdeckungen ist eine nicht-Variablen Sequenz, angrenzend an die Zielregion und die zweite Sonde (Sonde 2) Ergänzend zu der WT-Sequenz der Zielregion wo Mutationen sind zu erwarten (Abbildung 1 b). Während die erste Sonde den Gesamtbetrag der amplifiable Moleküle in der Reaktion quantifiziert, diskriminiert die zweite Sonde WT und MUT Allele durch suboptimale Hybridisierung auf mutierte Sequenzen. Fühler 2 kann mehrere Arten von Mutationen in der Ziel-Region (einzelne oder mehrere Nukleotid Substitutionen, löschen, etc.)-⁶identifizieren. Wie bei konventionellen DdPCR entspricht die helle graue Wolke Tröpfchen enthalten keine DNA-Moleküle. Es ist wichtig, daran zu erinnern, dass bei dieser Art des Tests, optimale Trennung von WT und MUT Wolken abhängig von der Menge der DNA geladen in der Reaktion ist, da Tröpfchen mit WT und MUT Ziel Allele von Tröpfchen enthalten nur das WT nicht zu unterscheiden Form. Dieser Test erfordert daher, dass die meisten Tropfen nicht mehr als eine Kopie des Gens gezielte enthalten.