특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

1. 샘플링 및 고정 순수한 문화: 깊은 동결15,17 세포 현 탁 액, 실 온 (RT)에서 5 분 동안 원심 분리기 및 5000 x g 2 mL를가지고 고는 상쾌한 삭제.참고: 샘플된 세포 현 탁 액 보충 파일 1-s 1에 설명 되어 있습니다. 또한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 6 m m 나2HPO4, 1.8 m m NaH2포4, 145 mM NaCl 이중 증 류 H2O, pH 7.2)의 1 mL에 셀 resuspend cryoprotective 대리인으로 15% (v/v) 글리세롤을 포함. 이후 스토리지-80 ° c.에 대 한 액체 질소에 얼음과 충격 동결에 10 분 동안 품 어참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 예제는 적어도 한 달 동안 안정. 슬러지 커뮤니티 활성화: 포름알데히드 안정화 + 에탄올 고정5,,1018 세포 현 탁 액, 3200 x g 15 ° C에서 20 분 동안 원심 분리기의 4 mL를가지고 고는 상쾌한 삭제.참고: 샘플된 세포 현 탁 액 보충 파일 1-s 1에 설명 되어 있습니다. PBS에서 2% 포름알데히드의 4 mL를 추가 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어 보존 첨가제 메탄올 액체 형태로 출하 하는 포름알데히드에 추가 하지 않으려면 paraformaldehyde에서 8% 포름알데히드 재고 솔루션을 준비 합니다. 70 ° c.에 50 mL PBS의 paraformaldehyde의 4 g 추가 약 125 µ L 10 M NaOH 솔루션을 추가 합니다. paraformaldehyde은 완전히 녹이 고 그것은 때까지 저 어 다음 실시간 조정 약 100 µ L 37%와 7.0 pH 값을 HCl. 동결 15 mL aliquots에서 포름알데히드 솔루션 저장소에 대 한 진정. 녹여 aliquots 10 일 이상 사용 하지 마십시오.주의: 포름알데히드 처리 하 여 주의 그것의 독성 및 돌연변이 속성 때문에 삭제 해야 합니다. 그것을 처리 하는 동안 항상 착용 장갑. paraformaldehyde 녹이는 동안 배기 후드를 사용 하 여 유독 가스에 노출 되지 않도록. 샘플 15 ° C와 3200 x g 에서 10 분 원심 하 고 삭제는 상쾌한. 70% 에탄올과-20 ° c.에 게 4 mL에 샘플 resuspend참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 예제는 2 개월 이상 안정. 샘플 속성에 따라 1.2.1에서 원심 분리 단계 또한 시간을 절약 하 4 ° C에서 10 분 동안 수행할 수 있습니다. Biogas 커뮤니티: 건조 2 mL 튜브에 점성 digestate의 샘플 200 µ L 잘린된 1000 µ L 피 펫 팁을 사용 합니다. PBS 버퍼의 1700 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 35 kHz와 80 W 효과적인 출력 1 분 동안 큰 셀 집계를 해산 하 고 식물 세포 잔류물에 집착 하는 세포를 분리 하는 초음파 목욕으로 튜브를 놓습니다. 샘플을 철저 하 게 혼합, 샘플 50 µ L 메쉬 필터를 통해 필터링 하 고 약 400 µ L의 4 aliquots는 filtrate 나눕니다.참고: 두 가지 주요 이점을 제공 합니다이 시점에서 aliquots을 준비. 첫째, 더 작은 볼륨은 기계적 탈수를 빠르고 쉽게 (원심 분리기)와 열 (건조), 하지만 두꺼운 biogas 슬러지에서 일반적으로 작은 볼륨의 샘플링은 매우 도전적 일 수 있다. 둘째, 추가 샘플 후속 셀 정렬, 백업 측정 또는 컨트롤에 사용할 수 있습니다. 10 ° C와 4000 x g 에서 10 분 동안 두 번 aliquots 원심 하 고 기계적으로 샘플을 최대한 철저 하 게 탈수 하는 상쾌한 완전히 두 번 삭제. 35 ° C, 약-97 kPa와 안정 된 펠 릿을 만드는 2500 x g 에서 40 분 동안 온수 진공 원심 분리기에서 샘플을 건조. 어둠 속에서 4 ° C에서 펠 릿을 저장 합니다.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 알 약 6 개월 이상 안정 있습니다. 2. 얼룩 참고: DAPI 얼룩 고해상도 도트 플롯을 제공 하는 입증 하 고 따라서 사회를 분석할 때 특히 유리 하다. 얼룩 솔루션에 DAPI 농도 셀 게이트 형광 강도 잡음 레벨 이상 하지만 구슬 아래를 보장 하기 위해 최적화 해야 합니다. 최적 악기 감도 구슬 선택에 따라 달라 집니다, 그리고 샘플 세트 포함 된 미생물의 G/C 내용 때문에 사이 다를 수 있습니다 및 일반적으로 새로 도입된 된 샘플 집합에 대 한 테스트 해야 합니다. 0.24 μ M DAPI에서 1 사이의 농도 테스트 µ M DAPI 제시 설치 권장 됩니다. 특정 응용 프로그램에 다른 염료를 사용할 수 있습니다. 사용 SYBR 녹색의 프로토콜을 얼룩이 나 때 정확도 계산 하는 절대 세포 지문 분석 (보충 파일 1-S1)6,15통해 우선 좋습니다. 그것은 더 적은 샘플 처리 및 원심 분리 단계를 포함 하 고 고정 및 중요 한 셀에 적용 됩니다. 중요 한 세포를 사용 하 여 샘플 처리 단계 건너뛰는 고정을 줄여 더 하며 따라서 하나만 원심 분리 세포 수확에 대 한. 이 잠재적인 셀 손실 및 따라서 체계적인 측정 에러를 최소화합니다. PBS, permeabilization 버퍼 및 모든 다음 단계 동안 사용 되는 솔루션 얼룩 0.2 µ m 주사기 필터 샘플에 추가 입자 부하 감소를 통해 필터링 해야 합니다. 대장균 BL21 포함 한 샘플의 얼룩이 지기 (DE3) 모든 샘플 수영장 생물학 표준 권고. 순수한 문화 샘플, RT 및 5000 x g 에 5 분 동안 원심 분리기를 녹 인 다 고는 상쾌한 삭제. 반복 pipetting으로 얼음 차가운 PBS에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 0.035을 OD700nm 조정 (경로 길이멧 = 0.5 m). 얼룩에 대 한 셀을 준비 합니다. 조정된 세포 현 탁 액 RT 및 5000 x g 5 분의 1 mL를 원심 및 삭제는 상쾌한. 0.3 M 구 연산 및 4.1 mM Tween20 permeabilization 버퍼의 1 mL에 셀을 resuspend 하 고 철저 하 게 혼합. 다음 얼룩에 대 한 투과성 세포 막 만드는 얼음에 10 분에 대 한 샘플을 품 어. 원심 RT 및 5000 x g에 5 분에 대 한 샘플 하 고는 상쾌한 삭제. 0.68 µ M DAPI 417 m m 나2HPO4/NaH2포4 버퍼 (289 m m 나2HPO4, 128 m m NaH2포4 이중 증 류 H2O, pH 7)에 포함 된 솔루션을 얼룩이 지기의 1 mL을 추가, 혼합 및 어둠 속에서 RT에 적어도 15 분 동안 품 어.참고: 정확한 OD 조정은 DAPI 농도 일정 하 게 유지 하는 경우 셀 밀도와 DAPI 형광 달라 집니다 때문에 유사한 측정을 보장 하기 위해 중요 합니다. 상쾌한 세포 손실을 방지 하기 위해 일반적으로 깨지기 쉬운 펠 릿 때문에 신중 하 게 제거 되어야 한다.주의:을 변이 원 성 속성으로 인해 주의 DAPI를 처분. 활성된 슬러지 커뮤니티 고정된 샘플을 철저 하 게 혼합 하 고 0.6 mL 유리 튜브로 전송. 1.4 mL PBS의 추가 하 고 단계 1.3.3에서에서 설명 된 대로 RT에서 10 분 동안 sonicate. 샘플 4 ° C와 3200 x g에서 10 분 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다. PBS의 2 개 mL를 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 5 분 동안 sonicate. OD700nm 0.035을 조정 (경로 길이멧 = 0.5 cm) PBS와 함께. 얼룩에 대 한 셀을 준비 합니다. 샘플 4 ° C와 3200 x g 에서 10 분 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다. Permeabilization 버퍼 0.11 M 구 연산 및 4.1 m Tween20 m의 1 mL에 셀을 resuspend 하 고 철저 하 게 혼합. RT 만드는 다음 얼룩에 대 한 투과성 세포 막에서 20 분 동안 품 어. 샘플 다시 4 ° C와 3200 x g 에서 10 분 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다. 0.68 µ M DAPI 및 417 m 나2HPO4/NaH2포4 버퍼를 포함 하는 얼룩 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 철저 하 게 혼합 적어도 60 분 RT 어둠 속에서 품 어.참고: 유리 튜브의 사용은 권고, 특정 미생물 플라스틱 튜브 벽에 고착 하는 경향이 하 고 과정에서 손실 될 수 있습니다. 잠복기 밤새는 것도 가능 하 고 일반적으로 실험실 절차를 단순화 합니다.주의: DAPI 처리 하 여 주의 돌연변이 속성 때문에 삭제 해야 합니다. Biogas 커뮤니티 PBS에서 말린된 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. PBS의 800 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 혼합 한 펠 렛 15 분 동안 담가 보자. 1000 µ L 피 펫과 액체 단계를 발음 하 고 젖은 펠 렛 피 펫 팁 튜브 벽의 원통형 섹션으로 이동. 그것은 거기에 충실 해야한다. 튜브 벽을 따라 펠 릿 스쿼시 원형 모션에서 피 펫 팁을 이동 합니다. 튜브 벽을 따라 피 펫 팁에서 액체 단계를 분배 하 여 관 벽에서 결과 슬러리를 세척. 발음을 피펫으로에 몇 번이 고 일시 정지를 교 반 하십시오. PBS와 샘플을 두 번 씻어. 4000 x g 10 ° C에서 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. PBS의 1500 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 한번 위의 두 단계를 반복 합니다. 튜브 1 분 동안 초음파 목욕으로 단계 1.3.3에서에서 설명 된 대로 놓고, 그 후, 개별 유리 튜브로 50 µ L 메쉬 필터를 통해 각 샘플을 필터링 합니다. OD700nm 0.035을 샘플의 2 개 mL를 희석 (경로 길이멧 = 0.5 cm) PBS와 함께. 2.2.3 위의 단계에서 설명한 대로 얼룩에 대 한 셀을 준비 합니다. 0.24 μ M DAPI를 포함 하는 얼룩 솔루션의 2 mL 및 417 m 나2HPO4/NaH2포4 버퍼, 철저 하 게 혼합을 추가 하 고 어둠 속에서 RT에서 밤새 품 어.주의: DAPI 처리 하 여 주의 돌연변이 속성 때문에 삭제 해야 합니다. 3입니다. 측정 참고: 모범 샘플 세트는 두 개의 서로 다른 흐름 cytometers로 분석 되었다. PC와 ASC, 매우 조절 더 복잡 하 고 쉽게 사용자 정의 연구 중심된 셀 정렬으로 분석 되었다. PC 분석에 대 한이 장치 설정에서 설명한 이전 게시16, 짧은 파란색 최대 레이저 장착 했다 (488 nm, 400 mW)와 자외선 (334-364 nm, 100 mW) 아르곤 이온 레이저. ASC 분석, 최신 블루 (488 nm, 400 mW) 및 자외선 (355 nm, 150 mW) 반도체 레이저를 설치 했다. 두 경우 모두, 블루 레이저 유도 (대역 통과 필터 488 nm ± 5 nm, 중립 밀도 필터 1.9) FSC 그리고 SSC (대역 통과 필터 488 nm ± 5 nm, 중립 밀도 필터 1.9, 트리거). 이러한 광학 특성 셀 크기와 세포 밀도, 각각 관련 됩니다. UV 레이저 흥분 DAPI 형광 (대역 통과 필터 450 nm ± 32.5 nm) 세포질 DNA 콘텐츠의 정량화에 대 한. 유체 시스템은 최대 0.3 psi에서 샘플 압력와 70 μ m 노즐 56 psi (3.86 바)에서 실행 되었습니다. 모든 매개 변수는 측정 해상도 개선 하기 위해 피크 넓이 대신 피크 높이로 기록 되었다. Biogas 커뮤니티의 장기 모니터링는 덜 복잡 한 흐름 베트, 벤치 가기 분석기와 함께 실시 했다. 자 외 반도체 레이저 (355 nm, 50 mW)는 FSC를 유도 하는 데 사용 되었다 (대역 통과 필터 355 nm ± 5 nm) 및 SSC (대역 통과 필터 355 nm ± 5 nm, 트리거) 신호 DAPI 형광을 흥분 (대역 통과 필터 455 nm C). 두 소자의 칼 집 버퍼에 대 한 사용 물 필터링 이중 증 류와 0.1 µ m 이었다. PBS 샘플 희석 사용 가능한 측정 입자 소음을 줄이기 위해 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 필터링 해야 합니다. 순수한 문화 및 활성된 슬러지 커뮤니티 악기, 레이저, 컴퓨터 및 소프트웨어를 시작 하 고 샘플 분석에 대 한 준비. 레이저에 전환 하 고 15 분 작동 온도 도달 하 고 빔 안정성 보장을 실행 합니다. 이중 증 류 H2O 작업 솔루션 x 0.2 희석 칼 집 버퍼 (19 m m KH2가4, 38 m m KCl, 166 m m 나2HPO4, 이중 증 류 H2O 1.39 M NaCl) x 10 칼 탱크를 채우기 (셀 정렬: 0.5 x 작업 솔루션)입니다. 압력 및 대략 6 psi 진공 폐기물 탱크 56 psi 유체 시스템 프라임. 린스 샘플 포트, 튜브, 노즐 Backflush 모드에서 최소 15 분 동안 악기를 실행 합니다. 표준 구슬과 보정. 구슬 믹스는 선형 (1 μ m 블루 + 2 μ m 노란색-녹색 형광)에서 교정에 대 한 준비 및 로그 범위 (0.5 μ m, 1 μ m 블루 형광). 동등한 농도 달성 하기 위해 원래 재고 정지에서 구슬 정지 희석. 지속적으로 선형 구슬 믹스를 측정 하 고 노즐을 조작 하 여 미리 설정 된 교정 서식 구슬 봉우리를 맞는 레이저 광학 위치 미리 선형 범위에 악기를 보정 하. 스위치는 로그 범위를 지속적으로 측정 로그 구슬 믹스. 악기의 하드웨어를 미세 조정에 그들의 미리 교정 서식 구슬 봉우리에 맞게. 광 전 증폭 관 관 (Pmt)의 이득 설정을 사용 하 여 구슬 위치에 최종 조정을 합니다. 경 음악 잡음의 위치를 확인 하 고 교정 서식에 맞게 조정 가능.참고: 구슬의 위치에 대 한 고정된 교정 서식 파일 측정 프로젝트 전에 준비 하 고 (보조 파일 1-S4 참조) 변경할 수 없습니다! 경 음악 노이즈 샘플 또는 전자 잡음은 Pmt의 입자에 의해 유도 될 수 있다 그리고 항상 어느 정도 기록 될 것 이다. 이득 조정 또는 플롯 오프셋에 의해 소음을 완전히 숨길을 권장 하지 않습니다. 풍요로 움과 잡음 이벤트의 위치 정보의 귀중 한 소스 수 있으며 따라서 원시 데이터에 포함 되어야 합니다. 매우 입자 집중 샘플 플로팅 및 데이터 분석 이유로 잡음의 후속 제거 할 거 수 있습니다. 악기의 안정성을 보장 하 고 따라서 comparability을 측정 하루 동안 정기적으로에 교정을 제어 합니다. 2.1.4에 설명 된 대로 포함 하는 생물 학적 표준 샘플을 측정 (DAPI 스테인드 대장균 BL21 (DE3), 샘플링 및 단계에서 고정 (16 h) 1.2에서 설명 ASC 프로토콜에 따라 고정). 그들의 사전된 교정 템플릿 (참조 보조 파일 1-S5) 기준 피크 위치를 확인 하십시오.참고: 일상적인 얼룩 및 샘플의 모든 풀의 생물학 표준 측정 될 것입니다 또한 얼룩 절차에 대 한 내부 통제. 비즈를 사용 하 여 장치는 교정 생물학 표준 미리 교정 서식 파일 맞지 않는 경우에, 얼룩 절차는 아마 반복 해야 합니다. 샘플 취득입니다. 10 분 샘플 포트와 튜브를 헹 구 고 후속 샘플에 DAPI 형광의 안정성 보장 얼룩 솔루션을 실행 합니다. 얼룩진된 샘플 cytometer 노즐의 막힘 방지 또는 모 세관 흐름을 측정 하기 전에 50 μ m 메쉬 필터와 필터링. 악기 안정성 모니터링 회고전 교정 검사에 대 한 가능성을 제공 하는 샘플에 로그 구슬 믹스를 추가 합니다. 샘플은 두 개의 구슬 게이츠의 각 1000 및 2500 이벤트 사이 포함 되어야 합니다. 새로운 샘플 세트의 첫 번째 시험 측정 동안 악기 소프트웨어에서 셀 게이트를 만듭니다. 이 게이트는 스테인드 셀을 포함 하 고 소음 및 구슬 제외 해야 합니다. 샘플을 혼합 하 고 250000 셀 (커뮤니티) 또는 50, 000 셀 (순수한 문화) 셀 게이트 내에서 감지 될 때까지 3000 이벤트의-1 의 최대 속도에서 측정 한다.참고: 이러한 셀 수 샘플 세트와 경험에 따라 선택 됩니다. 다른 숫자는 측정 효율성과 낮은 풍부 subcommunities 어느 방향으로 감지 간의 거래와 교대로 사용할 수 있습니다.문제 해결: 갑자기 내부 측정 구슬의 그리고 세포 위치 갇혀 노즐에서 공기 방울에 의해 발생할 수 있습니다. 이 제거 하 고 칼 집 버퍼 유체 시스템의 세 정 노즐의 청소 필요로 합니다. 악기 (시작 단계 3.1.2) 노즐을 탑재 후 재조정 될 필요가 있다. Backflush 칼 집 종료 하 고 샘플을 전환 하기 전에 버퍼와 철저 하 게 악기. Biogas 커뮤니티 악기, 레이저, 컴퓨터 및 소프트웨어 샘플 분석에 대 한 준비를 시작 합니다. Backflush 적어도 6 mL 튜브 및 샘플 악기 소프트웨어의 “칼 집 액체 황금” 기능을 사용 하 여 느슨하게 연결 된 튜브로 포트를 통해 칼 집 버퍼 (이중 증 류 H2O). 이중 증 류 H2O에서 유체 시스템 미만 200 이벤트의-1 은 0.5 µ L s-1의 일반적인 흐름 속도로 감지 때까지 씻어 하 5 µ L s-1 를 측정 합니다. 시스템 보정. 구슬 믹스 (0.5 μ m, 1 μ m 블루 형광)를 준비 합니다. 동등한 농도 달성 하기 위해 원래 재고 솔루션에서 구슬 정지 희석. 지속적으로 로그4 범위에서 구슬 믹스를 측정 하 고 흐름 베트와 레이저 광섬유 위치를 조작 하 여 그들의 미리 설정 된 교정 서식 구슬 봉우리를 맞는. Pmt의 이득 설정으로 구슬 위치에 최종 조정을 합니다. 제어 생물 학적 표준 교정 단계 3.1.3에서에서 설명한 대로. 샘플 취득입니다. PBS의 1600 µ L에 얼룩진된 샘플의 400 µ L를 희석 하 고 그것을 측정 농도 테스트를 수행 하는 이벤트 수를 모니터링 합니다.참고: 조정 된 희석 속도 다른 샘플 소스에 대 한 필요할 수 있습니다. 이벤트 수 입자 앞으로 분산형 (보충 파일 1-s 2에 부정적인 예제)에서 해상도 손실을 방지 하기 위해 풍부한 샘플에서 1200 이벤트의-1 를 넘지 말아야 한다. 순수한 문화는 최대 2000 이벤트의-1을 측정할 수 있습니다. 이 첫 번째 시험 측정 동안 악기 소프트웨어에서 셀 게이트를 만듭니다. 이 게이트는 스테인드 셀을 포함 하 고 잡음과 비즈를 제외 해야 합니다. 최대 1200 총 이벤트의-1 에서 실행 하 고 추가 구슬 믹스 악기 안정성 모니터링 회고전 교정 검사에 대 한 가능성을 제공 하는 샘플 농도 테스트의 결과 따라 샘플을 희석. 샘플은 두 개의 구슬 게이츠의 각 1000 및 2500 이벤트 사이 포함 되어야 합니다. 혼합 하 고 250000 셀 (커뮤니티) 또는 50, 000 셀 (순수한 문화) 셀 게이트 내에서 감지 될 때까지 샘플을 측정 한다. 종료 및 스위칭 샘플 전에 철저 하 게 이중 증 류 H2O와 악기를 씻어. 4. 셀 정렬 참고: 셀 정렬 프로시저 추가 악기 설정 필요 하 고 게시 프로토콜12에 따라 수행 됩니다. 시작 단계 3.1.1-3.1.3에 설명 된 대로 악기를 보정 하지만 칼 집 버퍼의 작업 솔루션 x 0.5를 사용 하 여. DD 주파수 및 DD 진폭 드롭릿 휴식에서 찾을 수 설정 합니다. 편향도 격판덮개를 탑재 하 고 충전에 대 한 2-또는 4-방향 정렬 모드를 결정 합니다. 2 내부 드롭 지연 교정 수행 μ m 노란색-녹색 구슬 입자 또는 셀 심문에서 여행 하는 시간 범위를 정의 하는 스트림에 연결 된 마지막 한 방울 (레이저 안타 셀) 가리키도록. 6 회 20 구슬 유리 슬라이드에 정렬 하 고 드롭 지연 보정을 확인 하는 현미경으로 그들을 계산. 정렬 게이트 서식 파일을 준비 합니다. 사용은 “단일 및 한 놓기 모드: 가장 높은 순도 99%” 하지 2500 보다 높은 비율로 총 이벤트의-1 (4-방향 정렬 모드) 한 번에 최대 4 게이츠에 500000 셀 정렬. 원심 분리 (20000 x g, 6 ° C, 25 분)에 의해 세포를 수확 하 고 나중에 DNA 분리 및 시퀀싱에 대 한-20 ° C에서 펠 릿을 동결.참고: 방지 5% 미만으로 게이츠에서 셀 정렬 정렬 시간으로 관계 되는 풍부는 상대적 풍요에 반대로 비례. 개별 단계 셀 정렬 설명서에 자세히 설명 되어 있습니다. 필요한 셀 번호는 각 사용 사례 및 추출 프로토콜에 크게 의존. 수많은 방법이 적용 된: ddPCR (1000 셀17,19), 16S rDNA mcrA amplicon 시퀀싱 (500000 셀6,,1015)와 단백질 (최대 107 셀 x 1.1 16,17). 셀 정렬 정렬된 subcommunities에서 낮은 다양성 때문에 metagenomics 접근법과 결합 될 때 특히 유리한 것입니다.주의: 높은 전압으로 인해 정렬 절차 동안 편향 접시를 만지지 마십시오. 5. 데이터 분석 참고: cytometric 측정 일반적으로 균일 한 데이터 구조와 “cytometry 표준”.fcs 데이터 파일을 생성합니다. 그러나, 다른 cytometer 제조업체 약간 적응 시킨된 버전을 사용 하 고 오래 된 악기의 최신 FCS 표준 3.1 2010 소개 앞선 수 있습니다. 이 점 플롯 스케일링 문제, 다른 악기와 함께 모여 결과의 직접적인 비교를 방지 하는 발생할 수 있습니다. 그러나, 개별 데이터 요소 행렬, 각 분산형 및 다른 열에서 형광 강도 값의 라인에 항상 저장 됩니다. 제시 미생물 분석 파이프라인 미생물 subcommunities 위해 독특한 셀 크기와 DNA 콘텐츠를 사용 합니다. 이 매개 변수는 FSC와 DAPI 형광 채널 농도에 상관 (셀 정렬: 플로리다-4, 분석기: 플로리다-1) 및 subcommunity 클러스터 2 차원 FSC 대 DAPI 형광 플롯 시각 때의 결과. 이러한 점 플롯 해석과 흐름 cytometry 데이터의 분석을 허용 하 고는 일반적으로 로그 배율 조정. 그들은 독점 cytometer 소프트웨어 또는 타사 솔루션을 사용 하 여.fcs 파일에서 표시 될 수 있으며 자동된 (Cytometric 히스토그램 이미지 비교, 세련 된)에 대 한 기초 및 반자동된 (Cytometric 바코드, CyBar) 커뮤니티 분석. Cytometric 히스토그램 이미지 비교참고: 코드, 자세한 설명서와이 패키지에 대 한 설명서 http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html에서 사용할 수 있습니다. 그들은 또한 게시20되었습니다. 설치 및 R 패키지를 로드,.fcs 파일이 포함 된 작업 디렉터리를 설정 하 고 실행 하 여 파일 목록을 설정.> 소스 (“https://bioconductor.org/biocLite.R”)> biocLite(“flowCHIC”)> library(flowCHIC)> # 설정 작업 디렉터리 경로를 FCS 파일 있는 위치> # 따옴표에 경로 입력 합니다.> setwd(“”)> # 작업 디렉토리에 있는 FCS 파일의 파일 이름 목록을 가져오려면> 파일 <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")> # 패키지에 포함 된 FCS 파일의 파일 이름 목록을 가져오려면> 파일 <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),전체 패턴을 TRUE, = + = “*.fcs”)> # FlowFrame로 첫 번째 FCS 파일 읽기> 프레임 <-읽기. FCS(files[1],alter.names=TRUE,transformation=FALSE)> # 얻을 매개 변수/채널 이름 목록> unname(frame@parameters@data$name) “Fcs_to_img” 패키지 기능을 실행 하 여 cytometric 원시 데이터에 대 한 이미지를 만듭니다.> # 기본 매개 변수를 사용 하 여 히스토그램 이미지 만들기> fcs_to_img(files) “Img_sub” 패키지 기능을 실행 하 여 히스토그램 이미지의 하위 집합을 정의:> # 이미지 하위 집합 기본 매개 변수를 사용 하 여 히스토그램을 만들> img_sub (파일, ch1 = “FS. Log”,ch2=”FL.4.Log “) “Calculate_overlaps_xor” 패키지 기능을 실행 하 여 이미지 분석을 중복 및 XOR 값을 계산:> # 저장 모든 하위 집합 이미지의 이름을 목록으로> 하위 집합 <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")> # 중복 및 XOR 이미지를 계산 하 고 값을 기록 하는 두 개의 새로운 파일을> 결과 <-calculate_overlaps_xor(subsets) 비 미터 다차원 스케일링 (NMD) “plot_nmds” 패키지 기능을 실행 하 여 유사성 분석에 대 한 플롯 만들기:> # 샘플 NMD 플롯 표시> plot_nmds(results$overlap,results$xor) Cytometric 바코드참고: 코드, 자세한 설명서와이 패키지에 대 한 설명서 http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html에서 사용할 수 있습니다. 그들은 또한 게시11,12되었습니다. 모든 샘플에서 사용 하기 위해 마스터 게이트 템플릿을 개발할 수 있습니다. 드래그 앤 드롭 기능을 사용 하 여 분석 소프트웨어에.fcs 파일을 로드 합니다. 더블 클릭을 측정 하 고 FSC 대 DAPI 형광 음모를 열려면 해당 드롭다운 목록에서 x 축 및 y 축 매개 변수를 선택 합니다. 다각형 그리기 도구를 사용 하 여 이전 단계 3.1.4.5 3.2.4.4 분석 된 셀의 수를 제어 하 고 적절 하 게 이름을 하는 데 사용 하는 셀 게이트를 재현. 그것은 수영장을 모든 샘플 그룹에 샘플 목록에서 셀 게이트 항목을 끕니다. 셀 게이트 더블 클릭 하 고 셀 게이트 이벤트 시각화를 축 할당을 수정 합니다. 다음 게시 된 지침12 타원형 게이츠 도구로 subcommunities 샘플 세트에 정의 하 고 게이트 서식 파일의 무결성을 보장 하는 SSC 또는 다른 세 번째 매개 변수21 의 검색을 사용. 수영장, 제어 하 고 다른 샘플에서 subcommunity 할당을 조정 합니다. 상대 subcommunity 나타났는데 R 스크립트에 사용 하기 위해.txt 파일로 내보냅니다. 편집 탭 테이블 편집기를 엽니다. 모든 subcommunity 단계 5.2.1.5에서에서 정의 되었고 “부모의 주파수”로 출력 통계 설정에 대 한 열을 추가 하 고 그들의 이름을. 저장 형식 및 대상 선택 후 “테이블 편집기”에서 테이블을 만듭니다.참고: 분석 소프트웨어는 직접 상대 subcommunity 나타났는데를 제공합니다. 그들은 또한 셀 게이트에서 이벤트 수 개별 subcommunity 문에서 이벤트 수의 부서를 통해 얻을 수 있습니다. 값 없음 필드를 포함할 수 없습니다 (참조 설명서 및 특정 지침에 대 한 FAQ) R 코드에서 읽을 수 있도록 몇 가지 추가 요구 사항을 충족 하는.txt 파일에 탭 구분 매트릭스에 저장 해야 합니다. 설치 및 R 패키지를 로드 하 고 실행 하 여 데이터를 로드:> 소스 (“https://bioconductor.org/biocLite.R”)> biocLite(“flowCyBar”)> # 따옴표에 경로 입력 합니다.> setwd(“”)> # 부하 데이터 집합> data(Cell_number_sample)> # 표시 데이터> Cell_number_sample [,-1] “표준화” 패키지 기능을 실행 하 여 상대 나타났는데 정상화:# 데이터를 정상화, 2 자리 숫자를 인쇄normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2) 만들고 바 코드는 정규화의 원래 상대 나타났는데 boxplot “cybar_plot” 패키지 기능을 실행 하 여:Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))# 기본 매개 변수가 있는 플롯cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1]) 원래 상대 나타났는데 NMD 계획을 만듭니다.> Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)> Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))> # NMD 플롯 정규화 cel 숫자의> nmds(Normalized_mean) “상관” 패키지 함수를 실행 하 여 상관 관계 분석을 정규화 된 상대 나타났는데 및 다른 매개 변수를 만듭니다.> # 부하 데이터 집합> data(Corr_data_sample)> # 상관 관계 값 표시> Corr_data_sample [,-1]> # 실행 상관 관계 분석> correlation(Corr_data_sample[,-1])참고: 칙 및 CyBar 상대 나타났는데에 의존. 그러나, cytometry 바이오 응용 프로그램에 대 한 큰 관심의 수도 절대 핸드폰 번호를 확인할 수도 있습니다. 절대 휴대폰 번호를 확인 하려면 셀의 게이트 수 분석된 샘플 볼륨으로 나눕니다. 분석된 샘플 볼륨 샘플 (보충 파일 1-S7에 수식)로 알려진된 농도와 구슬 정지를 추가 하 여 확인할 수 있습니다. 벤치 가기 분석기는 직접 측정 하는 동안 샘플 튜브에 볼륨을 단정 하는 진정한 체적 계산 기능 또한 갖추고 있습니다. 셀 계산에 대 한 프로토콜을 얼룩이 나 SYBR 녹색을 사용 하는 것이 좋습니다.