Die Nutzung von Maus Splenocyten, Pathogen-assoziierte molekulare Muster Einfluss auf die Genexpression Uhr abzuschätzen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, mit der Maus splenocyten, um Pathogen-assoziierte molekulare Muster zu entdecken, die molekulare Uhr Genexpression verändern.
Abstract
Vom Verhalten, Genexpression regulieren ZIRKADIANE Rhythmen fast alle Aspekte der Physiologie. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Maus splenocyten mit der Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) Lipopolysaccharid (LPS), ODN1826 und Hitze getötet Listeria Monocytogenes hinterfragen und prüfen ihre Wirkung auf die molekularen zirkadianen Uhr. Bisher haben Studien untersuchen den Einfluss von LPS auf der molekularen Uhr mit einer Vielzahl von in Vivo und ex Vivo Ansätze aus einem Sortiment von Modellen (z. B. Maus, Ratte und Mensch) fokussiert. Dieses Protokoll beschreibt die Isolation und die Herausforderung des splenocyten sowie die Methodik zur Uhr Gen Ausdruck nach Herausforderung über quantitative PCR zu beurteilen. Dieser Ansatz lässt sich nicht nur der Einfluss der mikrobielle Komponenten auf der molekularen Uhr aber auch andere Moleküle zu bewerten, die Ausdruck der Uhr ändern kann. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um die molekularen Mechanismen wie PAMP-Toll-Like-Rezeptor-Interaktion beeinflusst Uhr Ausdruck auseinander zu necken.
Introduction
Der master-Clock bei Säugetieren, der 24 h Schwingungen für fast alle Aspekte der Physiologie und Verhalten orchestriert, liegt in den suprachiasmatischen Kern (SCN) des Hypothalamus1,2. Neben der Regulierung der biologischen Prozesse auf organismal Ebene, synchronisiert der master-Clock auch periphere zelluläre Uhren im gesamten Körper3,4,5. Während der molekularen Uhr Maschinen aus mindestens drei ineinandergreifenden transkriptionelle translationale Feedback-Schleifen besteht, besteht der Kern der Periode (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, und Uhr Gene6,7. Neben der Pflege des genaue Timing der molekularen Uhr Kern, einige ergänzende Uhr Genprodukte (z. B. Rev-Erbα und Dbp) regulieren auch Ausdruck des nicht-uhrengene, d. h. Uhr kontrollierten Gene (KVG)6 , 7.
Funktionelle Molekulare Uhren wurden in verschiedenen immun Gewebe (z. B. Milz und Lymphknoten)8 und Zellen (z. B. B Zellen, Dendritische Zellen, Makrophagen)8,9beschrieben. Diese Zellen erkennen und reagieren auf Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs), konservierte mikrobielle Komponenten über angeborene immune Anerkennung Rezeptoren wie Toll-Like-Rezeptoren (TLR)10. Bisher wurden 13 funktionale TLRs beschrieben, erkennen die mikrobielle Bestandteile wie bakterielle Zellwand-Komponenten, flagellar Protein und mikrobielle Nukleinsäuren10. PAMP, Lipopolysaccharid (LPS), eine Zellwand-Komponente von Gram-negativen Bakterien erkannt von TLR4, nachweislich zirkadianen Rhythmen auf organismal und molekularer Ebene zu verändern. Z. B. in Vivo Herausforderung der LPS induzierte photic-ähnliche Phase Verzögerungen Aktivität in Mäusen11 gemessen und führte zu reduzierten Uhr gen-Expression in der SCN und Leber in Situ Hybridisierung und quantitative PCR bestimmt, bzw. in Ratten12. Nach einer in-Vivo -Herausforderung mit LPS ergab die Analyse der menschlichen peripheren Blut Leukozyten13 und subkutanem Fettgewebe14 veränderte Expression von mehreren uhrengene gemessen über qPCR. Zu guter Letzt geändert ex Vivo LPS Herausforderungen des menschlichen Makrophagen und Maus peritonealen Makrophagen, führte auch zu Uhr Ausdruck qPCR14gemessen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um den Einfluss der PAMPs LPS, ODN1826 (synthetische Oligonukleotide mit unmethylated CpG Motive), zu bewerten und Hitze getötet Listeria Monocytogenes (HKLM), anerkannt von TLR4, TLR9 und TLR2, bzw. auf Molekulare Uhr Genexpression in Maus splenocyten. Das Protokoll enthält Maus Splenektomie, Splenocyte Isolierung und Herausforderung, RNA Extraktion, cDNA Synthese und qPCR Ausdruck mehrere uhrengene bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht für den rechtzeitigen Erwerb einer großen Anzahl von Immunzellen mit sehr kleinen Tier oder zellulären Manipulation, die dann ex Vivo mit verschiedenen PAMPs in Frage gestellt. Die molekulare Uhr hat gezeigt, dass verschiedene Aspekte der Immunantwort8,15,16modulieren, Störung der molekularen Uhr beeinträchtigt daher höchstwahrscheinlich die richtige zeitabhängige Variation von der Immunantwort. Darüber hinaus da Störungen des zirkadianen Rhythmen zu schweren Pathologien17,18,19,20führen können, kann es von Interesse für Forscher, splenocyten mit einer breiten Palette von Herausforderung sein Moleküle und deren Einfluss auf die Uhr zu beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Innerhalb dieses Protokolls kann ein Microvolume Spektralphotometer zur Quantifizierung und Beurteilung der Reinheit der verwendeten bei der Bestimmung der Genexpression RNA verwendet werden. Nukleinsäuren absorbieren UV-Licht bei 260 nm, Proteine in der Regel absorbieren Licht bei 280 nm, während andere potentielle Schadstoffe verwendet, während ein RNA-Extraktionsverfahren (z. B. Phenol) nachweisbar bei 230 sind nm. Daher, durch die Beurteilung der Extinktion (A) Verhältnis bei 260/280 nm (RNA zum Protein)…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fakultät Forschung aus der College of Arts and Sciences Dean Büro an der University of Hartford gewährt.
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
Referências
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