Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Keri L Colabroy; Katlyn Mayer

doi:10.3791/58012

JoVE Journal > Biochemistry

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Bioquímica

Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie, Rekonstitution und Assay ein Polyhistidine getaggt Metalloenzyme für das Grundstudium Labor

Published: August 23, 2018

doi:

10.3791/58012

Keri L Colabroy¹, Katlyn Mayer¹

¹Department of Chemistry,Muhlenberg College

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Tischplatte immobilisiert Metall Affinität Chromatographie Reinigung und anschließende Wiederherstellung der ein Polyhistidine markiert, nicht-Häm-Eisen bindende Dioxygenase für grundständige Lehre Labor geeignet.

Abstract

Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie (IMAC), Polyhistidine getaggt Proteine ist leicht von Studenten beherrschen und ist die am weitesten verbreitete Protein-Reinigung-Methode in der modernen Literatur geworden. Aber die Anwendung der Affinitätschromatographie auf Metall-bindende Proteine, insbesondere solche mit Redox empfindliche Metalle wie Eisen, beschränkt sich oft auf Labors mit Zugang zu einem Handschuhfach – Ausrüstung, die nicht routinemäßig in die undergraduate Labor. In diesem Artikel zeigen wir Ihnen unsere Benchtop Methoden zur Isolierung, IMAC Reinigung und Metall-Ionen Rekonstitution von einem Poly-Histidin getaggt, Redox-aktiven, nicht-Häm-Eisen-bindende Extradiol Dioxygenase und die Dioxygenase mit abwechslungsreichen Untergrund-assay Konzentrationen und Sauerstoff zu sättigen. Diese Methoden werden ausgeführt durch Studierende und grundständige Lehre und Forschung Labor mit Instrumentierung, die leicht zugängliche und erschwingliche vor allem undergraduate Institutionen umgesetzt.

Introduction

Die ersten Berichte über die Reinigung eines Polyhistidine tagged Proteins aus Extrakten von einen Wirtsorganismus Chelat von Histidin-Tag von einem immobilisierten Metall mit die Literatur in 1988¹^,²eingetragen. Seit dieser Zeit sind die Zugabe von Polyhistidine-Tags, um rekombinante Proteine und ihre Reinigung von immobilisierten Metall Affinitätschromatographie (IMAC) praktisch allgegenwärtig in der biochemischen Literatur³^,⁴^geworden, ⁵. IMAC Reinigungsverfahren können auf die Benchtop mit automatisierten Chromatographie und Spin-Spalte Formate umgesetzt werden. Während Affinität Reinigungsmethoden, vor allem IMAC im Forschungslabor weit verbreitet sind, sind sie weniger häufig im Labor grundständige Lehre. Die am weitesten verbreitete Labor Lehrbücher für Biochemie Labor Lehren nicht routinemäßig dieser Methoden, sondern entscheiden sich für traditionellere Ionenaustausch oder Farbstoff-Bindung Chromatographie⁶^,⁷^,⁸ ^, ⁹. Z. B. die Reinigung von Laktat-Dehydrogenase durch Anderson¹⁰ verwendet Affinität von Farbstoff-Bindung, und die Reinigung des bovinen Milch α-Lactalbumin⁷^,¹¹ von Boyer verwendet eine Nickel-Nitriloacetic Säure-Matrix, aber keine rekombinante Poly-Histidin-Tag, verlässt sich stattdessen auf intrinsische Affinität des Proteins für das Harz. Einige moderne Bachelor Labor Lehrbücher und Publikationen setzen immobilisierten Metall Affinitätschromatographie auf Poly-Histidin getaggt Protein-Targets wie grün oder rot fluoreszierende Proteine¹²^,¹³^, ¹⁴^,¹⁵, Antikörper¹⁶und ausgewählte Enzyme¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰, sogar einige unbekannte Funktion²¹. Wohl ist die Reinigung eines Enzyms im Labor Lehre vorzuziehen, da das Ziel für Aktivität in nachfolgenden Sitzungen untersucht werden kann, bereichern die Erfahrung der “Wissenschaft” seitens der Schülers; in der Tat, diese Art von Labor Erfahrungen veröffentlicht wurden und vorteilhafte Ergebnisse auf Lernerfolge berichtet¹⁷^,¹⁸^,²⁰^,²¹. Und doch, Anwendungen der IMAC, Enzym-Reinigung in der Biochemie Labor bleiben spärlich, und die veröffentlichten Methoden können sogar davon ausgehen Zugang zu Chromatographie-Instrumentierung, die in der Regel nicht verfügbar für Unterricht im Klassenzimmer Labor ²⁰. es gibt auch Einschränkungen bei der Anwendung der IMAC zu Metalloproteine, insbesondere diejenigen, die Redox-Sensitive zweiwertige Metallen zu binden, die wesentlich für Aktivität²². Häufig, die Metall-Ionen verloren geht oder oxidiert während der Reinigung ein inaktiven Enzyms ungeeignet zum Bachelor Labor nachgeben.

Eine vollständige ein Drittel der Enzyme binden ein Metallion²³, und trotz nahezu universelle Voraussetzung für Eisen in allen Formen des Lebens²³, Eisen ist wohl unter den problematischsten Metallionen in Enzymologie. Nicht-Häm-Fe^{2 +} Bindung Enzyme sind besonders anfällig für Verlust und/oder Oxidation des Metalls während der IMAC; vermutlich aufgrund des Fehlens eines engagierten organischen Liganden wie Häm und die Leichtigkeit, mit welcher, die FE^{2 +} von Aminosäure-Liganden²⁴distanzieren können. Ferner ist die Sauerstoff-abhängige Oxidation von Fe^{2 +} zu Fe^{3 +} spontan in wässriger Lösung, durch die negative freie Energie-Änderung und die relative Stabilität von Fe^{3 +}. Oft sind diese Herausforderungen durch Verwendung von anaeroben Atmosphäre und/oder nicht-IMAC Chromatographische Methoden²². In diesem Artikel zeigen wir die Verwendung von Benchtop IMAC die Fe^{2 +} abhängige Metalloenzyme l-DOPA-Dioxygenase mit einfachen und kostengünstigen Chromatographie Zubehör, gefolgt von der Wiederherstellung der aktiven Seite Fe^{2 +}, zu reinigen und enzymatische Assays. Diese Methoden sind standard in unserem eigenen Bachelor Biochemie Labor von 6-12 Studentengruppen und können verwendet werden, um das Repertoire der Enzym-Untersuchungen auf der Bachelor-Ebene zu erweitern.

Protocol

1. Vorbereitung für die Reinigung Vorbereitung der zellfreien roh-Extrakt Erhalten Sie einen ~ 9-10 g Zelle Pellet von E. Coli (BL21), die die Polyhistidine getaggt Metalloprotein25 in einem 50 mL konische Röhrchen überexprimiert. ~ 9-10 g Pellet-Zelle für ein Gesamtvolumen ~ 45-50 mL 5 mL pro Gramm Raum temp Lyse/Bind Puffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol bei pH 8) hinzufügen. In regelmäßigen Abständen Vortex Auflösung zu fördern. Wenn das Pellet gefroren war, in ein lauwarmes Wasserbad Auftauen. Mit Eis-Wasserbad, chill der Zellsuspension auf ~ 3 ° C in Vorbereitung auf die Zelle Lysis.Hinweis: An dieser Stelle ist die Zelle Lyse durch Beschallung, Korn Mahlen oder eine andere Methode möglich. Korn Mahlen wird hier gezeigt, weil es schnelle, relativ preiswert, und keinen Gehörschutz erfordert. Montieren Sie ein 50 mL Korn Mahlen Kammer nach den Anweisungen des Herstellers. Die Perle Mühle voll, halb, der voll, gekühlt 0,1 mm Glasperlen, die bei-20 ° c gelagert wurde Füllen Sie den Rest der Kammer mit der gekühltes Zellsuspension und verwenden Sie 4 ° C Lyse/Bind Puffer, um die Kammer vollständig zu füllen. Einem kleinen Spatel zum Drehen der Welle die Rührwerksmühle und mischen die Zellsuspension mit den Perlen. Entfernen Sie große Bläschen mit einer pipettieren, und Schrauben Sie den Deckel auf. Trocknen Sie die Kammer von Undichtigkeiten. Die klare, plastische Jacke ca. 1 Tasse Eis hinzu, Invertieren Sie die gefüllten 50 mL Kammer in das Eis gefüllte Jacke und Schraube geschlossen. Sichern Sie die Eis-ummantelten Kammer auf den Motor. Schalten Sie die Rührwerksmühle auf motor für 15 Sekunden bei 15.800 u/min, dann 45 Sekunden ruhen lassen. Wiederholen Sie 8 Mal. Wenn die 8 Zyklen abgeschlossen sind, Dekantieren der gesamten Zellsuspension Lyse in ein 50 mL oder größeres Rohr für high-Speed Zentrifugation (25.000 x g oder höher) bewertet. Legen Sie ein paar ausgewogene Röhren in Zentrifuge und Spin bei 25.000 x g für 40-45 Minuten bei 4° C, pellet-Zelle Schutt und Glasperlen.Hinweis: Wenn 50 mL oder größere Rohre ausgelegt für high-Speed Zentrifugation nicht verfügbar sind, entfernen Sie die Glasperlen durch Zentrifugieren bei 1000-2000 x g für 2-3 min. in einem 50 mL konische Rohr auf ein kleineres Volumen der Zellsuspension (~ 25 mL) hervorbringen, die in einem kleineren Volum dekantiert werden können e-Rohr für high-Speed Zentrifugation bewertet. Bei der Zentrifugation abgeschlossen ist, Dekantieren Sie die klar, gelb, zellfreie, grobe Extrakte in ein sauberes 50 mL konische Röhrchen. Achten Sie darauf, keine Fremdkörper Zelle übertragen. Sammeln Sie eine kleine Auswahl der rohen zellfreie Extrakte für die spätere Analyse der Reinigung durch SDS-PAGE26. Vorbereitung der IMAC-Spalte Erhalten Sie eine 1,5 x 20 cm-Spalte, ausgestattet mit einem unteren Bett, Harz Partikel, einen Luer Lock Anschluss und eine obere Kappe, die enthält auch ein Luer Lock Fitting zu behalten. Passen Sie die Luer-Lock-Steckdose mit einem Absperrhahn zu steuern. Arbeitet an der Tischplatte und sicher montieren Sie die Spalte auf einem Ring Stand. Erhalten Sie eine 50 %-Brei aus Nickel-gebundenen Nitriloacetic Säure (Ni-NTA) Harz in 20 % Ethanol, die bei 4 ° c gelagert wurde Vorsichtig schwenken die Flasche, um gleichmäßig das Harz wieder auszusetzen. Arbeiten bei Raumtemperatur und auf die Benchtop Gebrauch eine abgestufte pipettieren, 2 mL des BREIS, zurückzuziehen, die 1 mL Ausbeute wird abgerechnet, Harz binden 50-60 mg Polyhistidine Protein hat, und die Gülle in die Spalte zu übertragen. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie die überschüssige Speicherlösung durch die Schwerkraft aus dem Harz abtropfen lassen. Schließen Sie den Absperrhahn fest Ein Pasteur Pipettieren mit gekühlten Lyse/Bind Puffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol bei pH 8) vorsichtig hinzugeben und in der Spalte der Harz – mindestens 30 mL. Achten Sie darauf, nicht die Harzoberfläche stören. Führen Sie den Puffer, die Mauern der Spalte um Spritzer zu vermeiden. Equilibrate des Harzes dadurch, dass des Lyse/Bind-Puffers, langsam aus der Spalte durch die Schwerkraft in eine Sammlung Becherglas abgießen. Wenn die Lyse/Bind Puffer meist leer ist, schließen Sie den Absperrhahn um den Fluss des Puffers zu stoppen, wenn ~ 5 mL Lyse-Puffer über den Harz bleibt und lassen Sie die Spalte, aufrecht, bis bereit zu gehen oder für bis zu 1 Woche montiert. 2. Reinigung der Polyhistidine-markierte Ziel von IMAC Waschpuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol pH 8) und Elution Buffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, 10 % Glycerin pH 8) vorbereiten. Entspannen Sie bei 4° C. Bereiten Sie die Ni-NTA-Spalte für den Zusatz von Rohöl zellfreie Extrakte indem Sie den Absperrhahn öffnen und verbleibende Lyse/Bindung Puffer durch die Schwerkraft durch das Ni-NTA-Harz abtropfen lassen. Wenn der Puffer geleert hat, und die Harzoberfläche ausgesetzt ist, schließen Sie den Absperrhahn. Mit einer Pasteur pipettieren, sorgfältig pipettieren extrahiert die Zelle frei Rohöl auf dem Harz, kümmert sich nicht um die Oberfläche zu stören. Führen Sie die grobe Extrakte, die Mauern der Spalte um Spritzer zu vermeiden. Das Volumen der groben Extrakte angewendet ist abhängig von der Höhe der Expression des Proteins Polyhistidine-Tags; Stellen Sie sicher, das Gesamtvolumen der groben Extrakte enthält 50-60 mg oder weniger des Zielproteins pro mL Ni-NTA-Harz (siehe Punkt 1.2.4). Wenn alle der groben Extrakte auf die Spalte übertragen wurden, der Absperrhahn geöffnet, sodass die Spalte durch die Schwerkraft abfließen kann. Diese Strömung durch besteht aus Proteinen, die nicht an das Harz – sammle 100 μL für die spätere Analyse der Reinigung durch SDS-PAGE gebunden. 26 Die Viskosität der rohen zellfreie Extrakte kann die Schwerkraft fließen der Spalte erheblich verlangsamen. Um die Rate von Strömung zu erhöhen, gelten Sie eine einfache “Handpumpe”: Nehmen Sie eine Spritze 10 mL Luer-Lock und schließen Sie es an die Kappe von der Spalte, die über ein kurzes Stück Kunststoffschlauch und Luer-Lock-Armaturen zwischen der Spalte GAP und die Spritze. Ziehen Sie den Spritzenkolben, und dann passen Sie die Spalte Kappe an der Oberseite der Spalte fest. Komprimieren Sie sanft den Kolben der Spritze während manuell Beurteilung des Durchfluss durch das Sammeln der Eluent in einem Messzylinder; Preise von 1-2 mL pro Minute sind kompatibel mit dem Harz und dieses Setup. Kompression des Spritzenkolbens zunehmender sanft die Fließgeschwindigkeit verlangsamt. Um zu verhindern das Eindringen von Luft in den Harz, entfernen Sie die Spalte Kappe Handpumpe befestigt, wenn der Meniskus der angewandten Flüssigkeit 5-10 mm oberhalb des Harzbettes erreicht und ermöglichen das restliche Volumen durch die Schwerkraft ablaufen. Wenn freie Rohöl zellextrakte, Entleeren beendet haben und die Harzoberfläche wieder ausgesetzt ist, verwenden Sie einen Pasteur pipettieren sorgfältig ~ 30 mL gekühlten Waschpuffer hinzufügen der Spalte – kümmert sich nicht um die Oberfläche des Harzes zu stören. Führen Sie den Puffer, die Mauern der Spalte um Spritzer zu vermeiden. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie Waschpuffer durch die Säule abtropfen. Dieser Prozess ist schwach gebundenen Proteine aus dem Harz entfernen. Das Laufmittel zu verwerfen. Während die Waschpuffer abläßt, bereiten sechzehn, beschriftet, Mikrozentrifugenröhrchen zum Sammeln von 1 mL Fraktionen. Wenn die Waschpuffer abgelassen wurde und die Harzoberfläche wieder ausgesetzt ist, schließen Sie den Absperrhahn. Verwenden Sie ein Pasteur pipettieren sorgfältig ~ 30 mL gekühlten Elution Puffer hinzufügen der Spalte – kümmert sich nicht um die Oberfläche des Harzes zu stören. Führen Sie den Puffer, die Mauern der Spalte um Spritzer zu vermeiden. Öffnen Sie den Hahn langsam und ermöglichen des Elution Puffers, Polyhistidine tagged Proteins aus der Spalte zu eluieren. Sammeln Sie 1 mL Eluent in jedem markierten Mikrozentrifugenröhrchen, 1 bis 16. Testen Sie die Brüche für Protein mit einer kolorimetrischen Protein Assay wie der Bradford-Test oder UV-VIS Spektroskopie nach bestimmten Methoden durch das Reagenz und/oder Instrument Hersteller27,28. Wie hier dargestellt, ist die kolorimetrischen Probe mit Coomassie blau 100 μL Volumen verkleinert um nur eine kleine Menge von einzelnen Fraktionen zu opfern. Mix 3 μL der einzelnen Fraktionen mit 100 µL einer kolorimetrischen Protein assay Reagenz und manuell die Bildung einer beliebigen Farbe an das Vorhandensein von Protein in der Fraktion zu beobachten; Erkennung mit einem Spektrometer ist nicht notwendig. Wenn Protein im Bruch 16 gefunden wird, weiter eluierenden 1 mL Fraktionen und Assay für Protein in regelmäßigen Abständen, bis der eluierten Brüche nicht mehr eine erhebliche Menge an Protein enthalten. Kombinieren Sie proteinhaltigen Fraktionen in einer sauberen konischem Rohr und abheben Sie eine 100 μl Probe für eine spätere Analyse durch SDS-PAGE26. Rekonstitution der Metall-Ionen Cofaktor fortsetzen Sie oder frieren Sie des Proteins in 3 mL Aliquote bei-80 ° C ein. Stellen Sie sicher, dass 10 % Glycerin ist enthalten in der Elution Puffer ist ein kryoprotektivum, reine Protein beim Gefrieren zu stabilisieren. Wenn Elution der Ni-NTA Spalte abgeschlossen ist, d. h. das Protein ist aus der Spalte und gesammelt in Sekundenbruchteilen, passieren eine weitere 25 mL Elution Puffer durch die Säule, und speichern die Spalte bei 4 ° C in ~ 5 mL Elution Buffer für kurzfristige Lagerung , oder Lyse/Bind Puffer mit 20 % Ethanol für die längerfristige Lagerung. 3. Wiederherstellung des Zielproteins mit Fe2 + Zugabe von Fe2 +Hinweis: Eine nicht-Häm-Eisen (II) binden Enzym, wie die l-DOPA-Dioxygenase in diesem Beispiel benötigt ein Fe2 + Ion für Aktivität; aber das Eisen (II) oxidiert leicht zu Eisen (III), die nicht aktiv ist, und ein Bruchteil des Proteins reinigt ohne Eisen überhaupt. Um die Wiederherstellung des Metalls zu beginnen, erhalten Sie 3 mL des gereinigten Enzyms in Elution Puffer suspendiert. Wenn gefroren, tauen Sie schnell mit einem lauwarmen Wasserbad, und einmal aufgetaut, das Protein auf Eis gelegt. Verwenden das Volumen des Proteins in der Röhre, berechnen Sie die Menge von Natrium Ascorbat (198.1 g/Mol) notwendig, um die Endkonzentration 12,5 mM in der Probe. Außerdem berechnen Sie die Höhe der Dithiothreitol (DTT, 154.25 g/Mol) notwendig, um die Endkonzentration 12,5 mM in der Probe. Fügen Sie die solide Natrium Ascorbat und DVB-t und mischen Sie sanft, aber gründlich, um vollständig auflösen. Achten Sie darauf, nicht Proteinfällung mit übermäßig aggressive mischen verursachen. Fügen Sie eine kleine Menge von Eisen (II) Sulfat Heptahydrat (MW 278.01 g/Mol) der Protein-Probe. Erlangung Kleinmenge am Salz, Eisen-Hahn ein paar 1 mm Granulat von FeSO4•7H2O solide, auf einem Blatt Papier wiegen, Falten Sie das Papier über das Untermodul “und mit der flachen Seite einer Metall Spachtel zerdrücken. Fügen Sie eine Prise Pulver am Rohr des Proteins. Vortex mischen und eine rosige rosa Farbe erscheint in der Röhre. Inkubieren Sie die rosa Lösung des Proteins begrenzt, für 10-30 Minuten auf dem Eis. Die rosa Farbe wird langsam im Laufe der Zeit verblassen. Gel-filtration Verwenden Sie eine Gel Filtration Spalte verpackt mit 10 mL der sphärischen Polyacrylamid-Gel mit einem Molekulargewicht Ausgrenzung Limit von ca. 6.000 und vielfältige hydratisiert Partikel Größe von 90 bis 180 µm in einer Spalte 1,5 x 12 cm, die auch mit einem 10 mL Reservoir ausgestattet ist. Stellen Sie sicher die Spalte ist ausgestattet mit untere und obere Bett unterstützt in Form von 30 Umm porösem Polyethylen Platten das Harz in der Spalte zu behalten und verhindern das Harzbett vor Trockenlauf. Montieren Sie die Gel Filtration Spalte zu einem Ring Stand. Wenn eine vorkonfigurierte Gel Filtration Spalte verwenden, entfernen Sie die Kappe und giesst den überschüssigen Puffer oberhalb der oberen Bett-Unterstützung. Um die Spalte equilibrate, zunächst füllen das Reservoir mit Puffer mit nachfolgenden Assay und -Speicherung, z. B. 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % Glycerin bei pH 8.0 kompatibel. Wenn eine vorkonfigurierte Gel Filtration Spalte verwenden, Abknicken der unteren Spitze des Gel-Filtration-Spalte, starten Sie den Fluss der Puffer und setzen das Luer Slip Fitting. Passt ein Absperrhahn Luer Slip Ende der Spalte, aber offen und ermöglichen die Spalte durch die Schwerkraft zu Tropfen. Wenn der Puffer aus der Spalte abgelassen hat und die obere Bett Unterstützung ausgesetzt ist, schließen Sie den Absperrhahn, und die ~ 3 mL Fe (II) rekonstituiert Metalloenzyme in die Spalte durch pipettieren die Lösung auf die freiliegenden oberen Bett. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie die gesamte 3,0 mL Probe geben Sie die Spalte durch die Schwerkraft. Entsorgen Sie diese ersten 3 mL Eluent. Eine rosa Farbe, die beim Umgang mit der Lösung bildet wird am oberen Rand der Spalte gefangen werden. Wenn die Spalte nicht tropft mehr und die obere Bett Unterstützung ausgesetzt ist, die Spalte mit fügen Sie 4 mL des Puffers Gel-Filtration (z.B. 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % Glycerin bei pH 8,0 hinzu). Öffnen Sie den Absperrhahn und sammeln Sie der Eluent in Mikrozentrifugenröhrchen auf acht 0,5 mL-Fraktionen. Testen Sie die Brüche für Protein mit einer kolorimetrischen Protein Assay oder UV-Vis27,28 , wie oben beschrieben. Protein-haltigen Brüche zu kombinieren. Eine Beispiel für SDS-PAGE-Analyse26zurückzuziehen. Fahren Sie mit Test oder Lagerung der Probe.

Representative Results

Diese repräsentative Ergebnisse wurden von Studenten gesammelt, wie sie dieses Protokoll zu Zeiten zwei Kurs Labor BCM 341 ausgeführt: experimentelle Biochemie am Muhlenberg College. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der Reinigung eine 20 kDa Poly-Histidin getaggt Metalloenzyme, l-DOPA-Dioxygenase, gespielt von zwei Studenten in einem Labor Zeitraum 4 Stunden Unterricht und durch die gleichen von SDS-PAGE analysiert Studenten während einer anschließenden Labor-Periode. Poly-Histidin-tagged Proteins ist effektiv gereinigt (Abbildung 1, Spur 2). Ein Immunoblot des Gels mit Antikörper gegen das Poly-Histidin-Tag weist darauf hin, dass eine kleine Menge des Zielproteins Poly-Histidin markiert im Durchflussverfahren (Daten nicht gezeigt), verloren geht wahrscheinlich weil die größer als 100 mg Menge des Zielproteins in der lysate überschritten die Bindungskapazität des Harzes. Abbildung 2 zeigt Schüler gesammelt Aktivitätsdaten auf der enzymatischen Reaktion von Poly-Histidin tagged Metalloenzyme Ziel, l-DOPA-Dioxygenase, nach der Rekonstitution mit Eisen (II) und anschließende Gel-Filtration wie beschrieben durch das Protokoll Hierin. Die fünf Sekunden Totzeit bevor Daten beginnt ist typisch für Studenten, die diese Technik zum ersten Mal ausführen. Die robuste Aktivität der Metalloenzyme wurde erkannt, mit einer veröffentlichten Assay und stationären kinetische Parameter mit veröffentlichten Ergebnisse29in Einklang gebracht. Steady State kinetische Parameter wurden durch den Einbau der Fortschritt Kurven30 in Abbildung 2dargestellte bestimmt; nichtlineare kleinste Quadrate Montage der ersten Sätze gesammelt über eine Reihe von Substrat-Konzentrationen ist jedoch ebenso möglich31. Abbildung 1: SDS-PAGE26 Analyse von Poly-Histidin getaggt Protein vor, während und nach der Reinigung. Bahnen 1 – Molekulargewicht Marker, 2 gereinigtes Protein (20 kDa) Post Ni-NTA, 3-Ni-NTA Durchströmung, 4 – kostenlose Rohöl zellextrakte vor der Reinigung, 5 – zellenrückstand Pellet Post Lyse. Proben wurden mit 5 x Probenbeladung/Puffer zubereitet und auf vorgegossenen 4-20 % Polyacrylamid-Gele mit einem Gel-Elektrophorese System getrennt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2. Steady-State-Test von Eisen (II) rekonstituiert Metalloenzyme (z.B. l-DOPA-Dioxygenase, 10µM) mit Substrat (l-DOPA-5 µM (rot), 25 µM (grün), 50 µM (blau)) im Puffer (50 mM Phosphat, 200 mM NaCl, pH 8). Spuren zeigen Produktbildung am 414nm. Extinktion Daten wurden kontinuierlich erworben, mit 1 mL Methacrylat Küvetten in einem Split-Beam Scan UV-VIS-Spektrometer29. RAW-Daten sind für ein Modell der Michaelis-Menten stationären Annäherung (KM 30,8 µM ± 14,4, kKatzeoffensichtlich 2.3 s-1 ± 0,05)30geeignet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Während die Zugabe von Polyhistidine-Tags, um rekombinante Proteine und ihre Reinigung von IMAC in der biochemischen Literatur³^,⁴^,⁵, Anwendungen der IMAC zu Enzym Reinigung praktisch allgegenwärtig geworden ist in der Biochemie Labor Lehre bleiben spärlich, und veröffentlichte Methoden halten nicht immer die begrenzten Ressourcen des Unterrichts Labor²⁰. Darüber hinaus ist die Verwendung des IMAC in der Lehre-Labor am effektivsten, wenn Experimente gekoppelt, die Aktivität und Reinheit, machen IMAC Reinigung eines Enzyms eine ideale Lehr Aktivität zu bewerten. Um die Anwendung der IMAC auf die Reinigung von Enzymen, einschließlich mechanistische, im Labor Lehre zu verlängern sind zuverlässige und kostengünstige Methoden notwendig. Wir zeigen in diesem Protokoll Benchtop IMAC mit leicht zugängliche und kostengünstige Laborbedarf, womit Sie auch die Einschränkungen bei der Anwendung der IMAC Metalloproteine²²durch Neuaufbau von Eisen(II) Metalloenzyme, l-DOPA-Dioxygenase, post-Reinigung. Mit den Reagenzien und Materialien beschrieben, schätzen wir die Kosten für Verbrauchsmaterialien für acht Studentengruppen zwischen 500-600 $ pro Semester dieses Protokoll, einschließlich der in Abbildung 1 und Abbildung 2beschriebenen Analyseschritte ausführen.

Wegen der Leichtigkeit, mit der Fe^{2 +} von Aminosäure-Liganden²⁴ und die einfache Oxidation von Fe^{2 +} O₂ , Fe^{3 +}, Rekonstitution von nicht-Häm, distanzieren können, ist Aminosäure chelated Eisen(II) in einem rekombinanten metalloenzyme eine typische Komponente der Enzym-Reinigung. Wenn klassische Chromatographie verwendet wird, ist es möglich, Totalverlust des Eisens in einigen Fällen³²zu vermeiden, aber immer öfter das Eisen (II) ist zurück im Beisein von Reduktionsmitteln³³^,³⁴^,³⁵^, hinzugefügt ³⁶ oft unter einer anaeroben Atmosphäre³⁷^,³⁸^,³⁹, und in einigen Fällen das überschüssige Eisen ist nicht entfernt³³^,³⁴^,³⁶, erschwert alle nachfolgenden Assay. Aufeinanderfolgende Stufen von klassischen Chromatographie und eine anaerobe Atmosphäre sind nicht realistisch für das Grundstudium Labor, woraufhin die Entwicklung dieses Protokolls.

Während die manuelle Vorbereitung der Ni-NTA-Spalte und der Verarbeitung von Proben weitgehend durch die Schwerkraft nimmt zusätzliche Zeit und Mühe im Vergleich zu abgepackten Spalten und Chromatographie Instrumentierung automatisierte, ermöglichen die manuelle Schritte zum Anfassen Lernen von den Studierenden, die zu erhöhten Verständnis der Wissenschaft hinter den Prozess führen. Die Zugabe von einem Eisensalz (II) unter den hier aufgeführten Bedingungen reagiert besonders empfindlich auf überschüssige Dithiothreitol. Wenn ein Schüler versehentlich ein Übermaß an Dithiothreitol hinzufügt, dürfte ein Niederschlag-Ereignis. Wir haben festgestellt, dass es hilfreich sein, müssen Studenten auf Berechnungen des Reagenz Mengen vor der Ankunft im Labor, so dass Labor Zeit am effektivsten bei der Bank eingesetzt werden kann. Die gesamte Benchtop IMAC Reinigung – von Zelle-Lyse zu Protein Elution – kann in einem 4-Stunden-Labor, gefolgt von Rekonstitution und Assay in zeitlich nachfolgende Labor erfolgen.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Publikation basiert auf der Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation Grant No. CHE 1708237.

Materials

consumables
BeadBeater 0.1mm glass beads	BioSpec Products	11079101	1 pound each
50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile	VWR	21008-178
Sodium chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Potassium phosphate, monobasic	Acros (Fisher)	AC42420-5000
Sodium Ascorbate	Acros (Fisher)	AC35268-1000
DTT (Dithiothreitol)	Lab Scientific	D-115
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigmaaldrich	310077
HisPur NiNTA Resin	Fisher (pierce)	PI88221
Econo-Column Chromatography Columns – 1.5 x 20cm	Bio-Rad	737-1522	1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,
Stopcock Valve, one way, female to male luer	Kimble	420163-0000	pack of 50
BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)	VWR	301029
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer	Biorad	7318222
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer	Biorad	7318225
Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)	Bio-Rad	7318211	Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling
Glycerol	Fisher (Pierce)	17904
Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientitic	23236
Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL	VWR	89000-028
Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets	Fisher	13-676-10F
Fiserbrand universal pipet pump	Fisher	14-955-110
Fisherbrand Transfer Pipets	Fisher	13-711-9AM
Econo-Pac 10DG desalting columns	Bio-Rad	732-2010	box of 30
ExpressPlus PAGE 5x sample buffer	Genscript	MB01015	5mL (Dilute 1:5 with sample)
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells	Genscript	M42012	20 gels
Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate	Fisher	14-955-128	case of 500
Cuvette Caps Square Disposable	Fisher	14-385-999
L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)	Acros	D9628-5G
Permanent Equipment:
BeadBeater 50mL chamber	BioSpec Products	110803-50SS	1 chamber
BeadBeater	BioSpec Products	1107900-101	350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.
Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL	Fisher	3119-0050PK
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad	1658004	4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	100–120/220–240 V, power supply for high-current applications, includes power cord
UV-1800 with UV-Probe Software	Shimadzu	UV-1800
Kintek Global Kinetic Explorer	Kintek Corp	version 6	https://www.kintekexplorer.com/downloads/

Referências

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Colabroy, K. L., Mayer, K. Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (138), e58012, doi:10.3791/58012 (2018).