Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Keri L Colabroy; Katlyn Mayer

doi:10.3791/58012

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

Benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني، إعادة تشكيل ومقايسة من بوليهيستيديني معلم متالونزيمي للمختبرات الجامعية

Published: August 23, 2018

doi:

10.3791/58012

Keri L Colabroy¹, Katlyn Mayer¹

¹Department of Chemistry,Muhlenberg College

Summary

نقدم هنا بروتوكول benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني لتنقية وإعادة تشكيل اللاحقة من بوليهيستيديني معلم، والحديد الهيم غير ملزم ديوكسيجيناسي مناسبة للمختبر التدريس الجامعي.

Abstract

Benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني (ايماك)، البروتينات بوليهيستيديني معلم يتقن بسهولة من طلاب المرحلة الجامعية، وأصبح الأسلوب تنقية البروتين الأكثر استخداماً في الأدبيات الحديثة. ولكن، تطبيق الفصل اللوني لتقارب ملزمة معدنية والبروتينات، وخاصة تلك مع الأكسدة المعادن الحساسة مثل الحديد، يقتصر غالباً على المختبرات مع الوصول إلى مربع القفازات-المعدات التي لا تتوفر بشكل روتيني في المرحلة الجامعية مختبر. في هذه المقالة، نظهر طرقنا benchtop للعزلة وإعادة تشكيل بولي-الحامض الأميني الموسومة تنقية وأيون المعدن ايماك، ديوكسيجيناسي اكستراديول الحديد الأكسدة النشطة، الهيم غير ملزم والمقايسة من ديوكسيجيناسي مع الركازة متنوعة تركيزات وتشبع الأكسجين. هذه الأساليب هي ينفذه طلاب المرحلة الجامعية وتنفيذها في مختبر التدريس والبحوث الجامعية مع الأجهزة التي متاحة وميسرة في المقام الأول من المؤسسات الجامعية.

Introduction

التقارير الأولى لتنقية البروتين بوليهيستيديني معلم من مقتطفات كائن مضيف باستخدام عملية إزالة معدن ثقيل العلامة الحامض الأميني من معدن المعطل تداولها دخلت في الأدب في عام 1988¹^،². ومنذ ذلك الوقت، أصبحت إضافة العلامات بوليهيستيديني للبروتينات المؤتلف وعلى تنقية بتقارب معدنية المعطل تداولها اللوني (ايماك) في كل مكان تقريبا في الأدب البيوكيميائية³^،⁴^، ⁵. يمكن تنفيذ أساليب تنقية ايماك في benchtop، باستخدام الفصل اللوني للألى وتنسيقات عمود الدوران. حين تقارب أساليب تنقية، خاصة ايماك، تستخدم على نطاق واسع في مختبر أبحاث، فأقل شيوعاً في مختبر التدريس الجامعي. الكتب الأكثر استخداماً من مختبر لمختبر الكيمياء الحيوية لا تعلم بشكل روتيني هذه الأساليب، اختارت بدلاً من ذلك للتبادل الأيوني أكثر تقليدية أو صبغ ملزم اللوني⁶^،^،من⁷⁸ ^, ⁹. على سبيل المثال، تنقية نازعة لاكتات أندرسون¹⁰ يستخدم تقارب بالصبغة الملزمة، والتنقية من حليب البقر α lactalbumin⁷^،¹¹ من بوير يستخدم من نيكل-نيتريلواسيتيك حمض مصفوفة، ولكن لا يوجد علامة المؤتلف بولي-الحامض الأميني، الاعتماد بدلاً من ذلك على تقارب جوهري من البروتين عن الراتنج. بعض المختبرات الجامعية الحديثة الكتب والمنشورات تنفيذ الفصل اللوني لتقارب معدنية المعطل تداولها في بولي-الحامض الأميني معلم البروتين أهدافا مثل البروتينات الأخضر أو الأحمر نيون¹²^،¹³^، ¹⁴^،¹⁵و¹⁶من الأجسام المضادة والانزيمات المحددة¹⁷^،¹⁸^،^،من¹⁹²⁰، حتى بعض من وظيفة غير معروف²¹. يمكن القول بأن تنقية إنزيم الأفضل في مختبر التدريس، لأن الهدف الذي يمكن أن يكون جزيئي للنشاط في الدورات اللاحقة، إثراء تجربة “العلم الحقيقي” من جانب الطالب؛ وفي الواقع، تم نشر هذه الأنواع من التجارب المختبرية وأفادت نتائج مفيدة في تعلم الطلبة¹⁷^،¹⁸^،^،من²⁰²¹. وحتى الآن، استخدام تطبيقات ايماك لتنقية الإنزيم في تدريس مختبر تظل ضئيلة، وقد تفترض الأساليب المنشورة حتى الوصول إلى أجهزة القياس اللوني الذي لا يتوفر عادة للكيمياء الحيوية في المختبر الفصول الدراسية ²⁰-وهناك أيضا أوجه القصور في تطبيق أي ماك ميتالوبروتينس، لا سيما تلك التي تربط المعادن divalent المراعية للأكسدة والاختزال التي تعتبر أساسية للنشاط²². وكثيراً ما أيون معدني مفقود أو تتأكسد أثناء تنقية الغلة إنزيم غير نشط غير ملائمة للمختبرات الجامعية.

ثلث كامل من إنزيمات الربط أيون معدني²³، وعلى الرغم من مطلب يكاد يكون شاملا للحديد في جميع أشكال الحياة²³، الحديد جدلا بين الأيونات المعدنية الأكثر إشكالية في علم الإنزيمات. عدم الهيم Fe^{2 +} ملزمة الإنزيمات عرضه بوجه خاص لفقدان و/أو أكسدة المعدن أثناء ايماك؛ يفترض أنه نظراً لعدم وجود يجند العضوية مخصصة مثل الهيم والسهولة مع الذي Fe^{2 +} يمكن أن ننأى عن الأحماض الأمينية يغاندس²⁴. وعلاوة على ذلك، الأوكسجين تعتمد أكسدة Fe^{2 +} إلى Fe^{3 +} عفوية في المحلول، بسبب تغير الطاقة الحرة السلبية واستقرار نسبي في Fe^{3 +}. وغالباً ما يتم التغلب على هذه التحديات باستخدام طرق الكروماتوغرافي الغلاف الجوي و/أو غير ايماك اللاهوائية²². في هذه المقالة، سوف نظهر استخدام benchtop ايماك لتنقية Fe^{2 +} ميتالوينزيمي تعتمد لدوبا ديوكسيجيناسي استخدام اللوازم اللوني بسيطة وغير مكلفة، تليها إعادة تشكيل موقع نشط Fe^{2 +}، و التحليل الأنزيمي. هذه الأساليب هي المعيار في مختبر الكيمياء الجامعية الخاصة بنا لمجموعات الطلاب 6-12 ويمكن استخدامها لتوسيع مرجع إنزيم التحقيقات على المستوى الجامعي.

Protocol

1-التحضير لتنقية إعداد استخراج النفط الخام خالية من الخلية الحصول بيليه خلية ز ~ 9-10 من كولاي (BL21) التي أوفيريكسبريسيد ميتالوبروتين بوليهيستيديني معلم25 في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. إضافة 5 مل جرام من غرفة المخزن المؤقت temp تحلل/ربط (50 مم الفوسفات، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 ملم في درجة الحموضة 8) ز ~ 9-10 بيليه خلية مل بإجمالي حجم ~ 45-50. دوامة دورياً لتشجيع حل. إذا تم تجميد بيليه، ذوبان الجليد في حمام الماء فاتر. استخدام حمام الماء المثلج، تشيل تعليق خلية إلى ~ 3 درجة مئوية في التحضير لتحلل الخلية.ملاحظة: عند هذه النقطة، الممكن تحلل الخلية sonication أو طحن حبة أو أسلوب آخر. ويتجلى طحن حبة هنا لأنها سريعة وغير مكلفة نسبيا، ولا تتطلب حماية الإذن. تجميع 50 مل حبة طحن الدائرة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تعبئة الدائرة طاحونة حبة نصف مليئة ببرود مم 0.1 الزجاج الخرز التي تم تخزينها في-20 درجة مئوية. ملء باقي الدائرة مع تعليق خلية يبرد واستخدام 4 درجات مئوية تحلل/ربط المخزن المؤقت لتعبئة الدائرة تماما. استخدام ملعقة صغيرة لتدوير رمح طاحونة حبة ومزيج تعليق خلية مع الخرز. إزالة أي فقاعات كبيرة مع بيبيت، والمسمار ثم الغطاء. الجافة خارج الدائرة من أي تسرب. إضافة حوالي 1 كوب من الجليد إلى سترة واضحة، والبلاستيك، وعكس قاعة مليئة 50 مل في سترة الجليد شغلها، والمسمار مغلقة. تأمين قاعة تغلف الجليد على المحرك. تشغيل طاحونة حبة السيارات على لمدة 15 ثانية في دورة في الدقيقة 15,800، ثم السماح للراحة لمدة 45 ثانية. كرر 8 مرات. عند إكمال دورات 8، صب تعليق تحلل الخلية بأكملها إلى 50 مل أو أنبوب أكبر تصنيفها للطرد المركزي عالية السرعة (25,000 x ز أو أعلى). وضع زوج من الأنابيب متوازنة في أجهزة الطرد المركزي، وتدور في 25,000 س ز لمدة 40-45 دقيقة على 4 درجة مئوية بيليه خلية الحطام والزجاج الخرز.ملاحظة: إذا لم تتوفر 50 مل أو أنابيب أكبر تصنيفها للطرد المركزي عالية السرعة، إزالة الخرز الزجاجية التي سينتريفوجينج في 1000-2000 × ز لمدة 2-3 دقيقة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل تعطي حجماً أصغر من تعليق خلية (~ 25 مل) التي يمكن أن تكون وفوجازارو في الحجم أصغر أنبوب ه تصنيفها للطرد المركزي عالية السرعة. عند الانتهاء من استخدام الطرد المركزي، صب الأصفر واضحة، وخالية من الخلية، واستخراج النفط الخام في أنبوب مخروطي نظيف 50 مل. الحرص على عدم نقل أي حطام الخلايا. جمع عينة صغيرة من مستخلصات الخام خالية من الخلايا لتحليلها في وقت لاحق للتنقية من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة26. إعداد العمود ايماك الحصول على مزودة بدعم سرير السفلي للاحتفاظ بجزيئات الراتنج ومنفذ قفل اللوير وغطاء العلوي يحتوي أيضا تركيب قفل اللوير عمود 1.5 x 20 سم. تناسب منفذ اللوير لوك مع محبس الحنفية التحكم بالانسياب. العمل على benchtop، بشكل أمن جبل العمود على الوقوف الدائري. الحصول ملاط 50% من الراتنج (ني-جاتا) حمض نيتريلواسيتيك النيكل زمنياً في الإيثانول 20% التي تم تخزينها في 4 درجات مئوية. بلطف دوامة الزجاجة بالتساوي إعادة تعليق الراتنج. تعمل في درجة حرارة الغرفة و benchtop، استخدام استقر بيبيت تخرج بسحب 2 مل الطين، التي ستسفر عن 1 مل من الراتنج قادرة على ربط 50-60 مغ بوليهيستيديني معلم البروتين، ونقل الملاط إلى العمود. فتح في محبس الحنفية ويسمح الحل التخزين الزائد لاستنزاف بالجاذبية من الراتنج. إغلاق محبس الحنفية أمان استخدام بيبيت باستور، إضافة بعناية برود تحلل/ربط المخزن المؤقت (50 مم الفوسفات، كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 ملم في درجة الحموضة 8 300 ملم) وإلى عمود راتنج – على الأقل 30 مل. الحرص على عدم الإخلال بسطح الراتنج. تشغيل المخزن المؤقت إلى أسفل جدران العمود إلى منع الرش. حجته الراتنج بالسماح لتحلل/ربط المخزن المؤقت لاستنزاف ببطء من العمود بالجاذبية في جمع كوب. عندما تحلل/ربط المخزن المؤقت معظمهم استنزفت، أغلق محبس الحنفية وقف تدفق المخزن المؤقت عندما لا يزال ~ 5 مل من المخزن المؤقت لتحلل أعلاه الراتنج واترك العمود، شنت وضع مستقيم، حتى على استعداد للمضي قدما أو لمدة تصل إلى أسبوع واحد. 2-تنقية معلم بوليهيستيديني الهدف من ايماك إعداد المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (50 مم الفوسفات، كلوريد الصوديوم، 300 مم 20 مم ايميدازول pH 8) وشطف المخزن المؤقت (50 مم الفوسفات، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 250 ملم، 10% والغليسيرول pH 8). البرد في 4 درجات مئوية. إعداد العمود ني-الإدارة الوطنية للسياحة بإضافة مستخلصات خالية من خلية النفط الخام بفتح في محبس الحنفية والسماح المتبقية في المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة لاستنزاف بالجاذبية من خلال الراتنج ني-الإدارة الوطنية للسياحة. عندما استنزفت كل المخزن المؤقت، ويتعرض سطح الراتنج، أغلق في محبس الحنفية. استخدام بيبيت باستور، بعناية بيبيت استخراج الخام الخلية الحرة على الراتنج، مع الحرص على عدم الإخلال بالسطح. تشغيل تستخرج النفط الخام أسفل جدران العمود إلى منع الرش. حجم النفط الخام مقتطفات تطبيق يعتمد على مستوى التعبير عن البروتين معلم بوليهيستيديني؛ ضمان أن إجمالي حجم النفط الخام مقتطفات تحتوي على 50-60 ملغ أو أقل من البروتين الهدف الواحد مل راتنج ني-جاتا (راجع الخطوة 1.2.4). عندما تم نقل كل من مستخلصات النفط الخام إلى العمود، فتح محبس الحنفية حيث يمكن استنزاف العمود بالجاذبية. هذا التدفق عن طريق يتكون من البروتينات غير ملزم إلى الراتنج – جمع ميكروليتر 100 لتحليلها في وقت لاحق للتنقية من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. 26 لزوجة مقتطفات الخلية الحرة الخام يمكن إبطاء تدفق الجاذبية من العمود إلى حد كبير. لزيادة معدل التدفق، تطبيق بسيط “المضخات اليدوية”: تأخذ حقنه 10 مل اللوير لوك وتوصيله إلى الحد الأقصى للعمود باستخدام مدة قصيرة من الأنابيب البلاستيكية وملحقاتها اللوير لوك بين كاب العمود والمحاقن. استخلاص المكبس المحاقن، وثم تناسب محكم الغطاء العمود على رأس العمود. ضغط المكبس المحاقن بلطف أثناء تقييم معدل تدفق يدوياً عن طريق جمع في الوينت إلى اسطوانة تخرج؛ معدل 1-2 مل في الدقيقة الواحدة متوافقة مع الراتنج وهذا الإعداد. زيادة ضغط المكبس حقنه بلطف كما يؤدي إلى إبطاء معدل التدفق. لمنع دخول الهواء إلى الراتنج، إزالة الغطاء العمود وتعلق المضخات اليدوية عند غضروف السائل التطبيقية تصل إلى 5-10 ملم فوق سرير الراتنج، والسماح لحجم المتبقية لاستنزاف بالجاذبية. عندما تستخرج النفط الخام مجاناً الخلية الانتهاء من تجفيف ويتعرض سطح الراتنج مرة أخرى، استخدام بيبيت باستور بعناية إضافة ~ 30 مل يبرد يغسل المخزن المؤقت إلى العمود – مع الحرص على عدم الإخلال بسطح الراتنج. تشغيل المخزن المؤقت إلى أسفل جدران العمود إلى منع الرش. فتح محبس الحنفية والسماح ليغسل المخزن المؤقت لاستنزاف من خلال العمود. هذه العملية هو إزالة البروتينات ضعيف منضم من الراتنج. تجاهل في الوينت. حين يستنزف المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، إعداد ستة عشر، المسمى، أنابيب ميكروسينتريفوجي لجمع الكسور 1 مل. عندما استنزفت المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، ويتعرض سطح الراتنج مرة أخرى، أغلق في محبس الحنفية. استخدام بيبيت باستور بعناية إضافة ~ 30 مل من المخزن المؤقت شطف مبردة إلى العمود – مع الحرص على عدم الإخلال بسطح الراتنج. تشغيل المخزن المؤقت إلى أسفل جدران العمود إلى منع الرش. فتح محبس الحنفية بطء والسماح شطف المخزن المؤقت الوت البروتين بوليهيستيديني معلم من العمود. جمع 1 مل الوينت في كل من أنابيب ميكروسينتريفوجي ملحوظ، 1 إلى 16. اختبار الكسور للبروتين باستخدام مقايسة بروتين اللونية مثل المقايسة برادفورد أو مطيافية الأشعة فوق البنفسجية-المرئية وفقا للأساليب المحددة بالكاشف و/أو صك27،الشركات المصنعة28. كما هو موضح هنا، يتم تحجيم مقايسة اللونية باستخدام أخذ الأزرق إلى وحدة تخزين 100 ميكروليتر من أجل التضحية سوى كمية صغيرة من كل جزء. ميكروليتر 3 مزيج من كل جزء مع 100 ميليلتر من البروتين اللونية الاعتداء الكاشف ومراقبة يدوياً تكوين أي لون للإشارة إلى وجود البروتين في الكسر؛ ليس من الضروري الكشف مع مطياف. إذا تم العثور على البروتين في جزء 16، مواصلة التينج الكسور 1 مل ومقايسة للبروتين بشكل دوري، حتى الكسور التيد لم تعد تحتوي على كمية كبيرة من البروتين. الجمع بين الكسور التي تحتوي على البروتين في أنبوب نظيف مخروطية، وتسحب عينة 100 ميكروليتر لتحليلها في وقت لاحق بالحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة26. المضي قدما في إعادة تشكيل مساعد أيون معدني أو تجميد البروتين في مختبرين 3 مل في-80 درجة مئوية. ضمان أن والغليسيرول 10% يتم تضمين في شطف المخزن المؤقت كريوبروتيكتانت على استقرار البروتين النقي أثناء التجميد. عند الانتهاء من شطف العمود ني-الإدارة الوطنية للسياحة، فجميع البروتين قبالة العمود وجمعت في الكسور، تمرير آخر 25 مل من المخزن المؤقت شطف من خلال العمود، وتخزين العمود عند 4 درجة مئوية في ~ 5 مل من شطف المخزن المؤقت لتخزين قصيرة الأجل ، أو تحلل/ربط المخزن المؤقت مع الإيثانول 20% للتخزين طويل الأجل. 3-إعادة تشكيل البروتين المستهدف مع الحديد2 + إضافة الحديد2 +ملاحظة: غير الهيم حديد (II) ملزمة الإنزيم، مثل ديوكسيجيناسي لدوبا في هذا المثال، يتطلب Fe2 + أيون للنشاط؛ بيد أن سهولة يكسد الحديد (II) إلى الحديد (III)، وغير نشط، وينقي جزء صغير من البروتين دون أي الحديد في جميع. للبدء في إعادة تشكيل المعادن، الحصول على 3 مل إنزيم المنقي علقت في شطف المخزن المؤقت. إذا جمدت، ذوبان الجليد سريعاً باستخدام حمام الماء فاتر، ومرة مذاب، وضع البروتين على الجليد. باستخدام وحدة تخزين البروتين في الأنبوب، حساب مقدار الصوديوم اسكوربات (198.1 g/mol) اللازمة لجعل التركيز النهائي 12.5 ملم في العينة. كما أن حساب كمية ديثيوثريتول (DTT، 154.25 g/mol) اللازمة لجعل التركيز النهائي 12.5 ملم في العينة. إضافة اسكوربات الصوديوم الصلبة و DTT وتخلط بلطف، ولكن دقة، حل تماما. الحرص على عدم تسبب ترسيب البروتين مع خلط مفرط العدوانية. إضافة كمية قليلة من كبريتات الحديد (II) هيبتاهيدراتي (278.01 ميغاواط g/mol) للعينة البروتين. بغية الحصول على كمية صغيرة بما يكفي من الصنبور الملح والحديد 1 عدد قليل مم حبيبات فيسو4•7H2س الصلبة خارجاً على قطعة من وزن الورق وإضعاف الورقة الحبيبية وسحق عليه مع الجانب المسطح من ملعقة معدنية. إضافة حبة مسحوق الناتجة إلى أنبوب البروتين. دوامة لخلط ولون وردي وردية ستظهر في الأنبوب. احتضان الحل الوردي من البروتين، توج، لمدة 10-30 دقيقة على الجليد. اللون الوردي وسوف تتلاشى ببطء مع مرور الوقت. هلام الترشيح استخدام عمود هلام ترشيح معبأة مع 10 مل من كروية polyacrylamide هلام مع حد استبعاد وزن الجزيئي حوالي 000 6 من ومجموعة حجم جسيمات رطب من 90 – 180 ميكرون في عمود 1.5 x 12 سم، وهو مجهز أيضا مع خزان 10 مل. ضمان مجهز العمود السفلي ويدعم السرير العلوي في شكل أقراص البولي إثيلين مسامية أم 30 الإبقاء على راتنج في العمود وسرير الراتنج إلى منع تشغيل الجاف. جبل العمود هلام الترشيح إلى موقف خاتم. إذا كان استخدام عمود ترشيح جل المعلبة، بإزالة الغطاء ومن أجل إيقاف المخزن المؤقت الزائدة أعلاه دعم السرير العلوي. لحجته العمود، تبدأ بملء الخزان مع المخزن المؤقت متوافقة مع التحليل اللاحق، والتخزين، على سبيل المثال، 50 ملم نة2بو4، 200 ملم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10% على درجة الحموضة 8.0. في حالة استخدام عمود ترشيح جل المعلبة، التقط قبالة الحافة السفلي هلام الترشيح العمود بدء تدفق المخزن المؤقت وفضح تركيب نظام كشف. يصلح محبس الحنفية إلى نهاية العمود، كشف اللوير ولكن تترك المجال مفتوحاً والسماح للعمود بالتنقيط بالجاذبية. عند المخزن المؤقت قد استنزفت من العمود، ويتعرض لها دعم السرير العلوي، أغلق في محبس الحنفية، وإضافة مل ~ 3 من متالونزيمي الحديد (II) أعيد إلى العمود قبل بيبيتينج الحل على دعم مكشوف من السرير العلوي. فتح في محبس الحنفية والسماح بالعينة مل 3.0 كامل إدخال العمود بواسطة الجاذبية. تجاهل هذه أول 3 مل من الوينت. سيتم المحاصرين أي اللون الوردي الذي تشكل أثناء التعامل مع الحل في الجزء العلوي من العمود. عندما توقف العمود نازف ويتعرض لها دعم السرير العلوي، إضافة 4 مل من المخزن المؤقت هلام الترشيح (مثلاً 50 مم نة2بو4، 200 ملم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10% على درجة الحموضة 8.0) إلى العمود. فتح في محبس الحنفية وجمع في الوينت في أنابيب ميكروسينتريفوجي على مدى ثمانية 0.5 مل الكسور. اختبار الكسور للبروتين استخدام مقايسة البروتين اللونية أو الأشعة فوق البنفسجية مقابل27،28 كما تم وصفه سابقا. الجمع بين الكسور التي تحتوي على البروتين. سحب عينة ل تحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة26. المضي في التحليل أو تخزين العينة.

Representative Results

وجمعت هذه النتائج ممثلة بطلاب المرحلة الجامعية كما أنها نفذت هذا البروتوكول خلال فترتين المختبر دورة 341 “بليون متر مكعب”: “الكيمياء الحيوية التجريبية” في كلية Muhlenberg. يوضح الشكل 1 معلم ميتالوينزيمي، ديوكسيجيناسي لدوبا، كما يؤديها اثنين من الطلاب الجامعيين خلال فترة مختبر 4 ساعة الفصول الدراسية وتحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة بنفس نتائج تنقية بولي كاتشين 20-الحامض الأميني الطلاب أثناء فترة مختبر لاحقة. بروتين بولي-الحامض الأميني الموسومة بشكل فعال المنقي (الشكل 1، لين 2). إيمونوبلوت من جل استخدام الأجسام المضادة ضد العلامة بولي-الحامض الأميني تشير إلى أن كمية صغيرة من البروتين المستهدف بولي-الحامض الأميني معلم يضيع في التدفق من خلال (البيانات لا تظهر)، المحتمل نظراً لأن أكبر من الكمية 100 ملغ من البروتين المستهدف في ليستي تجاوزت القدرة الملزمة من الراتنج. الشكل 2 يوضح بيانات الأنشطة التي تجمع الطلاب على رد فعل الانزيمية من الحامض الأميني بولي متالونزيمي المعلمة الهدف، ديوكسيجيناسي لدوبا، بعد إعادة تشكيل مع الحديد (II) والترشيح جل اللاحقة كما هو موضح بالبروتوكول وهنا. والثاني الخمسة يبدأ التوقيت الميت قبل جمع البيانات نموذجية من الطلاب تنفيذ هذا الأسلوب للمرة الأولى. تم الكشف عن نشاط قوي متالونزيمي استخدام مقايسة منشورة، وأسفرت عن حالة ثابتة معلمات الحركية يتسق مع النتائج المنشورة29. معلمات الحركية الحالة المستقرة هي التي تحدد تركيب منحنيات التقدم30 هو مبين في الشكل 2؛ تركيب المربعات الصغرى غير الخطية للمعدلات الأولية التي تم جمعها على مدى سلسلة من تركيزات الركيزة غير نفس القدر الممكن31. رقم 1. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة26 تحليل بولي-الحامض الأميني معلم البروتين قبل وأثناء وبعد التنقية. الممرات 1-علامات الوزن الجزيئي، 2-تنقية البروتين (كاتشين 20) وظيفة ني-الإدارة الوطنية للسياحة، وتدفق 3-ني-الإدارة الوطنية للسياحة من خلال الحطام خلية-خلية مقتطفات النفط الخام مجاناً قبل تنقية، 5-4 بيليه بعد تحلل. وأعدت 5 × عينة/تحميل المخزن المؤقت باستخدام عينات وفصلها عن المواد الهلامية polyacrylamide مسبقة الصب 4-20 ٪ باستخدام نظام التفريد هلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 2. أعيد فحص حالة ثابتة من الحديد (II) متالونزيمي (أي، لدوبا ديوكسيجيناسي، 10 μm) مع الركازة (لدوبا-5 ميكرومتر (أحمر)، 25 ميكرومتر (الأخضر)، 50 ميكرومتر (أزرق)) في المخزن المؤقت (50 مم الفوسفات، وكلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 8 200 ملم). تصوير آثار تشكيل المنتج في 414nm. تم اقتناء البيانات امتصاص باستمرار استخدام 1 مل ميثاكريلات الترعة في سبليت-شعاع المسح ضوئي الأشعة فوق البنفسجية-مرئية مطياف29. يتم احتواء البيانات الخام إلى نموذج ل تقريب حالة ثابتة (كم ± 30.8 ميكرومتر 14.4، كالقطالظاهر 2.3 s-1 ± 0.05) ميكايليس-مينتين30. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

بينما أصبحت في كل مكان تقريبا في الأدب البيوكيميائية³^،⁴^،⁵، تطبيقات ايماك لتنقية إنزيم إضافة العلامات بوليهيستيديني للبروتينات المؤتلف وتنقية واسطة ايماك التدريس مختبر تبقى متفرق في الكيمياء الحيوية، وأساليب المنشورة لا نعتبر دائماً القيود المفروضة على الموارد التدريس مختبر²⁰. وعلاوة على ذلك، استخدام ايماك في مختبر التدريس الأكثر فعالية عندما يقترن بتجارب تقييم النشاط والنقاء، مما يجعل ايماك تنقية إنزيم نشاط تعليمي مثالي. من أجل توسيع نطاق تطبيق ايماك لتنقية الإنزيمات، بما في ذلك ميتالوينزيميس، في مختبر التدريس، هناك حاجة إلى أساليب وموثوقة وغير مكلفة. في هذا البروتوكول، ونظهر benchtop ايماك استخدام اللوازم المختبرية متوفرة بسهولة وغير مكلفة، بينما أيضا على معالجة أوجه القصور في تطبيق ايماك ميتالوبروتينس²²، بإعادة تشكيل الحديد التابعة متالونزيمي، ديوكسيجيناسي لدوبا، وظيفة تنقية. استخدام الكواشف والمواد المذكورة، فإننا نقدر تكلفة المواد الاستهلاكية لثماني مجموعات طلابية من بين 500-600 دولار كل فصل دراسي لتشغيل هذا البروتوكول، بما في ذلك تحليل الخطوات المبينة في الشكل 1 و الشكل 2.

نظراً للسهولة التي Fe^{2 +} يمكن أن ننأى عن الأحماض الأمينية يغاندس²⁴ وأكسدة السطحية Fe^{2 +} س₂ إلى Fe^{3 +}، إعادة تشكيل غير الهيم، الحديد الثنائي من الأحماض الأمينية-بالكلاب في متالونزيمي المؤتلف عنصر نموذجي لتنقية الإنزيم. عندما يتم استخدام الفصل اللوني الكلاسيكي، فمن الممكن تجنب الخسارة الكلية للحديد في بعض الحالات³²، ولكن أكثر في كثير من الأحيان، يتم إضافة الحديد (II) إلى حضور وكلاء تخفيض³³^،³⁴^،³⁵^، ³⁶ غالباً تحت³⁸^،³⁷^،أتوموسفيري اللاهوائية³⁹، وفي بعض الحالات ليس من الحديد الزائد إزالة³³^،^،من³⁴³⁶، تعقيد أي مقايسة اللاحقة. خطوات متعاقبة اللوني الكلاسيكية وجو اللاهوائية ليست واقعية بالنسبة للمختبرات الجامعية، مما دفع تطوير هذا البروتوكول.

أثناء إعداد دليل للعمود ني-الإدارة الوطنية للسياحة وتجهيز العينات إلى حد كبير عن طريق الجاذبية تأخذ مزيدا من الوقت والجهد عند مقارنة بالأعمدة المعلبة والآلي أجهزة القياس اللوني، تسمح الخطوات اليدوية للتدريب العملي على تعلم الطالب الذي يؤدي إلى زيادة فهم العلم وراء هذه العملية. إضافة ملح الحديد (II) وفقا للشروط المبينة هنا حساس بشكل خاص إلى ديثيوثريتول الزائد. إذا كان طالب عن طريق الخطأ يضيف وجود فائض ديثيوثريتول، من المرجح حدث هطول الأمطار. ونحن قد وجدت أنه من المفيد تتطلب من الطلاب لإجراء عمليات حسابية لكميات كاشف قبل وصوله إلى المختبر، حيث يمكن استخدام الوقت المختبر الأكثر فعالية في مقاعد البدلاء. يمكن أن تتم تنقية ايماك benchtop أسرة-من تحلل الخلية إلى شطف البروتين-في فترة مختبر 4 ساعة واحدة، تليها إعادة تشكيل والمقايسة في فترة لاحقة مختبر.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويستند هذا المنشور إلى العمل المدعوم من “المؤسسة الوطنية للعلوم” تحت “رقم المنحة” تشي 1708237.

Materials

consumables
BeadBeater 0.1mm glass beads	BioSpec Products	11079101	1 pound each
50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile	VWR	21008-178
Sodium chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Potassium phosphate, monobasic	Acros (Fisher)	AC42420-5000
Sodium Ascorbate	Acros (Fisher)	AC35268-1000
DTT (Dithiothreitol)	Lab Scientific	D-115
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigmaaldrich	310077
HisPur NiNTA Resin	Fisher (pierce)	PI88221
Econo-Column Chromatography Columns – 1.5 x 20cm	Bio-Rad	737-1522	1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,
Stopcock Valve, one way, female to male luer	Kimble	420163-0000	pack of 50
BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)	VWR	301029
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer	Biorad	7318222
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer	Biorad	7318225
Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)	Bio-Rad	7318211	Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling
Glycerol	Fisher (Pierce)	17904
Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientitic	23236
Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL	VWR	89000-028
Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets	Fisher	13-676-10F
Fiserbrand universal pipet pump	Fisher	14-955-110
Fisherbrand Transfer Pipets	Fisher	13-711-9AM
Econo-Pac 10DG desalting columns	Bio-Rad	732-2010	box of 30
ExpressPlus PAGE 5x sample buffer	Genscript	MB01015	5mL (Dilute 1:5 with sample)
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells	Genscript	M42012	20 gels
Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate	Fisher	14-955-128	case of 500
Cuvette Caps Square Disposable	Fisher	14-385-999
L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)	Acros	D9628-5G
Permanent Equipment:
BeadBeater 50mL chamber	BioSpec Products	110803-50SS	1 chamber
BeadBeater	BioSpec Products	1107900-101	350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.
Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL	Fisher	3119-0050PK
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad	1658004	4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	100–120/220–240 V, power supply for high-current applications, includes power cord
UV-1800 with UV-Probe Software	Shimadzu	UV-1800
Kintek Global Kinetic Explorer	Kintek Corp	version 6	https://www.kintekexplorer.com/downloads/

Referências

Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321 (1988).
Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
Block, H., et al. Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).
Derewenda, Z. S. The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization. Methods. 34 (3), 354-363 (2004).
Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
Switzer, R. L., Garrity, L. F. . Experimental Biochemistry. , (1999).
Boyer, R. . Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. , (2001).
le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. . Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. , (2012).
Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. . Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. , (2013).
Anderson, A. J. Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 65 (10), 901 (1988).
Boyer, R. F. Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography. Journal of Chemical Education. 68 (5), 430 (1991).
Moffet, D. A. From gene mutation to protein characterization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).
Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).
Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).
Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. Green fluorescent protein in biotechnology education. Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).
Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. . Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. , (1996).
Arkus, K. A. J., Jez, J. M. An integrated protein chemistry laboratory. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).
Crowley, T. E. Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).
Colabroy, K. L. A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).
Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).
Gray, C., et al. Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).
Kocabas, E., Hernick, M. Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors. Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).
Ellis, W. R. Metalloenzymes. Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).
Williams, R. J. P., Begley, T. P. Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of. Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).
Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).
He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
He, F. Bradford Protein Assay. BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).
Johnson, M. Protein Quantitation. Materials and Methods. , (2017).
Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).
Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).
Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum. Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).
Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).
Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. 4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition. Bioquímica. 42 (7), 2072-2080 (2003).
Bugg, T. D. H. Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).
Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB). Bioquímica. 43 (42), 13390-13396 (2004).
Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).
Uragami, Y., et al. Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase. Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).
Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Colabroy, K. L., Mayer, K. Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (138), e58012, doi:10.3791/58012 (2018).