Summary

Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen

Published: June 25, 2018
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol om te bepalen van de gewenste omgevingstemperatuur van Drosophila larven met behulp van een continu thermisch verloop.

Abstract

Veel dieren, met inbegrip van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, zijn geschikt voor discriminerende minieme verschillen in omgevingstemperatuur, die hen toelaat om te zoeken naar hun voorkeur thermische landschap. Om de voorkeuren van de temperatuur van larven via een gedefinieerd bereik van de lineaire gedefinieerd, ontwikkelden we een bepaling met behulp van een temperatuurgradiënt. Om vast te stellen een single-directionele verloop, zijn twee aluminium blokken verbonden met onafhankelijke waterbaden, elk waarvan de temperatuur van de afzonderlijke blokken regelt. De twee blokken Stel de boven- en ondergrenzen van het verloop. De temperatuurgradiënt is opgericht door het plaatsen van een agarose-coated aluminiumplaat over de twee water-gecontroleerde blokken, zodat de plaat de afstand tussen hen overspant. De uiteinden van de aluminiumplaat die is ingesteld op de bovenkant van de water-blokken definieert de minimale en maximale temperaturen en de regio’s tussen de twee blokken vormen een lineair verloop van de temperatuur. De kleurovergang bepaling kan worden toegepast op de larven van verschillende leeftijden en kan worden gebruikt voor het identificeren van mutanten die vertonen fenotypen, zoals die met mutaties die genen coderend voor TRP channels en opsins, die nodig voor de discriminatie van de temperatuur zijn.

Introduction

Thermotaxis is werkzaam bij mobiele dieren te selecteren van een omgeving met de meest gunstige voorwaarden1,2,3. Als het klimaat is extreem warm of koud, dit probleem is van vitaal belang voor het voortbestaan. Daarnaast veel dieren zijn gevoelig voor zeer kleine verschillen in temperatuur in het comfortabele bereik en omgeving met een ideale temperatuur uitzoeken. Dit is van bijzonder belang voor poikilothermic organismen zoals fruitvliegjes, die equilibreer hun lichaamstemperatuur met het milieu. Testen om te controleren van larvale thermotaxis hebben bijgedragen in de identificatie en verduidelijking van de rol van moleculaire sensoren zoals Drosophila voorbijgaande Receptor potentiële (TRP) kanalen4,5,6, rhodopsins7,8, en ionotropic receptor receptoren (IRs)9, die deze dieren met temperatuur gevoeligheden begiftigen over verschillende temperatuurbereiken.

Een tweeweg multiple-choice test biedt een aanpak om te bestuderen van thermische voorkeuren in larven6,7. De bepaling brengt met zich mee tot de oprichting van twee verschillende temperatuurzones en laat de dieren om te selecteren van de ene kant boven de andere. De resultaten van twee richtingen keuze tests kunnen robuust, vooral als de temperatuurverschillen tussen de twee opties groot zijn. Bovendien, aangezien elke bepaling classificatie van slechts twee groepen impliceert, kan de gegevens worden uitgedrukt als een eenvoudige voorkeur-index. Het gemak en de eenvoud van twee richtingen keuze tests zijn ook vatbaar voor genetische schermen. Een belangrijk minpunt is echter dat veel experimenten nodig om de gewenste temperatuur van de wild-type of mutant dieren zijn.

Een kleurovergang assay biedt de mogelijkheid om de gewenste temperatuur in een enkele assay-8. Bovendien, in tegenstelling tot de twee richtingen multiple-choice test, het maakt het mogelijk de evaluatie van de verdeling van een groep dieren, wanneer geconfronteerd met een doorlopend bereik van temperaturen. Een kleurovergang assay gebruikt een petrischaal en enkele dieren en is geschikt voor het karakteriseren van de gedetailleerde gedrag van individuele dieren10. Echter, aangezien petrischaaltjes ronde zijn, de grootte van de temperatuurzones variëren en geleidelijk kleiner zijn afhankelijk van de afstand van het centrum. Dus, deze setup is niet ideaal voor het toezicht op de selecties van de temperatuur van de populaties van dieren.

Een continu thermisch kleurovergang apparaat dat is geschikt voor het beoordelen van de voorkeuren van de temperatuur van groepen van larven maakt gebruik van een rechthoekige arena en hier wordt beschreven. Het apparaat is eenvoudig te construeren en te assembleren. Bovendien, het verloop is lineair, en is flexibel, aangezien het kan worden gebruikt om te beoordelen van thermotaxis over grote temperatuur variëren van 10 ° C tot 42 ° C. De bepaling is snel en eenvoudig uit te voeren en reproduceerbare gegevens levert. Naast de rapportage van de favoriete temperatuur van larven, blijkt het de voorkeuren van de bevolking van dieren over een gehele lineaire bereik in een enkele experiment. Als gevolg van deze voordelen is het een uitstekende keuze voor de identificatie van genen die nodig zijn voor thermotaxis.

Protocol

1. apparatuur fabricage en montage apparaat voor kleurovergang Assays De aluminium assay platen voor de single-directionele kleurovergang assay fabriceren. Trim en slijpen van elke aluminiumplaat assay (figuur 1A) uit één stuk aluminium met behulp van een lintzaag en scherpe verticale molen met de volgende dimensies: de buitenste grootte is 140 x 100 x 9 mm en de binnenste grootte is 130 x 90 x 8 mm (figuur 1B). Anodize van de binnenkant van …

Representative Results

Om vast te stellen een 18 ° C – 28 ° C single-directionele kleurovergangen, we stellen de temperaturen van twee waterbaden op 16,8 ° C en 31 ° C. Door het meten van de temperatuur op 26 posities binnen de bovenste en onderste gedeelten van alle 6 zones, de randen tussen de zones, en aan de extreme uiteinden van het agarose gel oppervlak (figuur 2C, 2E) verkrijgen we de temperaturen op 13 punten. De verdeling van de temperatuur langs het v…

Discussion

Om het welslagen van dit protocol, is het belangrijk maatregelen te nemen voor het verkrijgen van voldoende aantal larven uit te voeren van de experimenten. Deze omvatten vooraf voeden de vliegen in gist plakken-bevattende flesjes voor 2-3 d te verbeteren met het leggen van eieren. De flesjes moeten worden geplaatst in een lade met flesjes water en ingesloten in een doorzichtige plastic zak, die houdt het vocht van het levensmiddel en bevordert effectief voeden door de larven terwijl blootstelling aan normale licht-donke…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

C.M. wordt ondersteund door de financiering van de NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) en de NIAID (1DP1AI124453).

Materials

Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath Thomas Scientific 9106 This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient) Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient) 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing McMaster-Carr 91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing Tygon 57296 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name Company Catalog Number Comments
Items and reagents for assay
Pestle USA Scientific 17361 Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer Fluke 51II
Thermocouple Fluke K type
Universal microplate lid Corning 6980A77
35 mm dish Corning 9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient) Fisher Scientific 15-951 Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose Invitrogen 16500500 Prepare 1% solution
Sucrose Sigma S0389-5KG Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush Fisher Scientific 11860
50 mL centrifuge tubes Denville C1062-P
Scoopula Fisher Scientific 14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle Pyrex 1395-500
Cell strainer (300 mm pore) PluriSelect 43-50300 Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray) Genesee Scientific FS32-124
Name Company Catalog Number Comments
Drosophila food
Distilled water 22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg LabScientific Inc. NC0535320 1,609 g
Brewers yeast 100 lbs MP Biomedicals ICN90331280 379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) Genesee Scientific 62-115 221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg) Genesee Scientific 66-103 190 g
Karo light corn syrup Karo 1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) Sigma Aldrich H5501-5KG 72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) Sigma Aldrich 81910-1 L 108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O Sigma Aldrich 438081-500 mL 8.5 mL

Referências

  1. Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
  2. Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
  3. Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
  4. Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
  5. Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
  6. Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
  7. Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
  8. Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
  9. Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
  10. Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
  11. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).
check_url/pt/57963?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57963, doi:10.3791/57963 (2018).

View Video