体外细胞生理学研究中视网膜微动脉的分离

这里所描述的所有实验都是按照1986年《英国动物 (科学程序) 法》中所载的准则进行的, 并得到贝尔法斯特女王大学动物福利和道德审查机构的批准。 1. 视网膜动脉的分离 注意: 下面的协议用于隔离视网膜动脉。本方法对大鼠视网膜小动脉进行了优化, 可用于鼠视网膜。然而, 当使用小鼠时, 血管的产量降低。 组成一个解决方案的低 Ca2 +包含汉克斯 ‘ (LCH), 如表 1所示。注: 此解决方案可存储3天, 在4摄氏度 (当使用存储 LCH, 确保它 equilibrates 室温和 pH 值是正确的使用前)。 在组织收集前组装以下设备, 确保视网膜快速显微切割: 锯齿钳、弯剪刀、解剖盘 (硅胶涂层培养皿)、单刃刀片、2套钳 (钝) 1 玻璃巴斯德吸管(火抛光到平滑但不狭窄的尖端), 1 一次性塑料吸管 (与尖端修剪, 以增加孔径 ~ 5-7 毫米), 1 玻璃圆底测试管 (5 毫升) 和持有人。醒酒约50毫升的 LCH 进入玻璃烧杯, 并准备第二个烧杯醒酒废液。注: 见规格和制造商详细资料表。 弄死大鼠使用 CO2后, 心脏穿刺抽血化验 (避免颈椎脱位或脑震荡, 因为这些可能会损害血管的眼睛)。用锯齿钳缩回眼睑, 然后用弯曲的剪刀绕着眼眶肌肉和视神经进行切割。轻轻地从轨道上抽出眼睛, 小心地用剪刀剪掉剩下的附件。 将眼睛浸入 LCH 溶液中, 在解剖盘上 (如有必要, 眼睛可以在冰上运输 LCH 的溶液)。用一组钝钳将眼睛固定在盘子上, 保持眼眶肌肉附着或视神经;确保锚点尽可能靠近巩膜以稳定眼睛。 使用刀片, 切开沿锯缘的角膜, 并通过用镊子轻轻地按压巩膜, 取出晶状体。 将眼杯通过光学盘对称地切成两半。使用闭合钳轻轻 ‘ 刷 ‘ 从眼罩的两个一半的视网膜, 照顾, 以消除任何其他附件在光盘。用第二只眼睛重复这个过程, 用塑料吸管和一小滴 LCH 培养基将经解剖的视网膜转移到试管中。 使用塑料吸管填充试管与 LCH 5 毫升, 并允许视网膜定居到底部。 通过从试管中除去4毫升溶液, 用塑料吸管添加新鲜 LCH, 清洗组织大约3次。如有必要, 去除多余的组织, 如悬吊韧带、玻璃体的幽默和毛发。 用 LCH 清洗玻璃巴斯德吸管 (抛光尖端) 的内侧, 防止组织粘附在吸管上。使用相同的吸管, 从试管中取出大约4毫升溶液。然后添加大约2毫升新鲜 LCH。 轻轻地将组织通过玻璃吸管的尖端, 慢慢地离解 (triturate) 视网膜, 并将其内容排出试管中。注意, 不要在这个阶段引入气泡。 重复步骤 1.10, 直到视网膜被分解为大约 2-3 毫米2的大小。 用大约2毫升的 LCH 清洗吸管的内侧, 将其排出试管中。允许内容结算到底部超过 5-10 分钟。 重复 1.10-1.12 中概述的研磨过程, 再用力一点, 直到组织片的尺寸约为1毫米2 。再次, 让组织解决 5-10 分钟。 重复步骤 1.10-1.12 第三次与更多的力量, 直到内容完全均匀化, 没有视网膜片保持 (解决方案应成为乳白色的外观)。注: 这项技术将产生多达 8 arteriolare 段 (相对没有周围的 neuropile 和一些分支保持完好) 每隔离测量 8-45 µm 直径和 200-2500 µm 长度。 将少量的隔离物转移到生理记录室或添加荧光染料用于测量胞内 Ca2 +浓度 ([Ca2 +]i; 见第3节)。根据当地处理动物粪便的规则, 处理隔离过程中的眼杯残留物和清除液。注: 在隔离后应立即对船只进行试验, 剩余的分离物可以储存在4摄氏度, 可达8小时。 2. 动脉压力 Myography 注: 动脉压力 myography 采用图 1A、 B和材料表中详细的设备进行如下操作。 将视网膜血管匀浆的整除 (1-2 毫升; 隔离为每节 1) 到生理记录室 (部分填充有名义上的 Ca2 +自由汉克斯的解决方案; 0Ca2 +汉克斯 ‘; 见表 1) 安装在舞台上的倒置显微镜。在试验前, 让船只在记录室底部沉降至少5分钟。 在整个记录室进行目视扫描, 以确定动脉 > 200 µm 长度, 并拥有一个开放端, 通过该容器可以空心 (在结果部分进一步探讨了容器类型的识别)。将容器定位在视野的中心。如果不存在合适的容器, 则按照步骤2.1 将另一整除的血管匀浆输送到记录室。 用细钳和小钨线滑移 (75 µm 直径和 2-4 毫米长度) 将容器的一端固定在容器上 (见图 1C(i))。要做到这一点, 握住钳中的导线, 并在录音室的上方找到镊子。 在显微镜下识别钳的相应阴影, 把镊子放到浴缸里, 直到电线变得明显。将导线从开端定位到大约200µm, 并将导线垂直于容器的长轴。注: 在插管和加压过程中, 钨线的重量足以咬合导管远端止流。 将动脉移动到记录腔内的适当位置, 使其在浴缸中水平放置, 并与加压套管一致 (见图 1C(ii iv))。这样做, 通过轻轻地轻推咬合钨丝滑与一个额外的部分导线在钳内举行;不要触摸动脉, 因为它将不可逆转地坚持钳。 如有需要 (对于长动脉段), 在该船只上添加额外的钨线滑块, 使该船只的闭塞和开口端之间的距离不超过200µm;这有助于防止动脉在加压时从视野中移出。如果该船只有任何侧面分支, 这些也应堵塞与额外的钨线滑移。如果一侧分支不能被遮挡, 则丢弃该容器。 灌注室与 0Ca2 +汉克斯 ‘ 在37°c, 以消除多余的视网膜组织和温暖的沐浴到生理温度。注: 标准的重力馈电浴灌注和在线加热器系统可用于这一目的 (见图 1A)。0Ca2 +汉克斯 ‘ 是用来促进插管程序, 因为去除外部 Ca2 +确保动脉保持扩张。 从 filamented 硼硅酸盐玻璃毛细管中制造增压套管 (尖端直径 ~ 3-10 µm 取决于容器的直径是空心的; 较小的船只需要更窄的套管; 请参阅材料表) 使用微电极拉拔和后填充 0Ca2 +汉克斯的解决方案。确保套管的小腿轻轻地向尖端倾斜, 以方便插管。 通过 Y 连接器和3路丝锥将套管安装在连接到10毫升注射器的吸管支架上;这用于对系统施加压力, 使用连接到 Y 连接器另一侧的压力计 (见图 1B) 来记录气压。注: 需要一个 ‘ 帮助 ‘ 吸管, 以协助插管过程。从微电极拉拔器上拔出的硼硅酸盐玻璃毛细管上制备吸管, 使其直径为 0.5-2 µm. 重的火擦亮吸管 (经常直到闭合) 使用 microforge。 使用3轴机械机械手, 小心地将辅助吸管放在直角, 靠近开口端的容器的长轴上 (见图 1D)。将助吸管放在容器上方, 但不接触它。 将插管吸管放置在容器的开口端 (见图 1D和2A(i)), 使用细机器人;根据显微镜 (20X) 调整焦距的平面, 将尖端置于开口附近。当容器的末端和套管尖端同时处于焦点时, 套管正确定位于插管 (见图 2A(ii))。 使用细机器人的 x 轴控制将增压套管推进到容器孔径中 (见图 2A(iii))。通过沿 y 轴移动套管来评估插管的成功与否。如果套管留在容器内, 它是成功的空心 (见图 2A(iv))。如果套管在容器外移动, 套管可能在容器上方;如果这样重复步骤 2.10-2.11 与套管在一个较低的平面在 z 轴。 成功插管后, 轻轻地将助吸管移到容器上, 以抑制动脉。引导动脉壁上的加压套管与帮助吸管, 同时, 因为插管吸管进一步推进到血管腔内的距离约 30-50 µm (见图 2A(v, vi))。注: 此过程需要同时控制移动两个机械手 (帮助吸管移向套管, 而套管进入血管腔), 并需要广泛的实践, 以达到高成功率。 将浴缸溶液改为2毫米 Ca2 + (见表 1) 在37摄氏度的正常汉克斯。通常这会导致动脉的轻微收缩, 并在加压套管周围形成紧密封。然后, 辅助吸管可以从容器中移开。 允许紧的封印开发15分钟. 使用 USB 摄像机 (和图像采集软件) 连接到显微镜并调整焦点以最大限度地提高容器边界与外部和腔内空间之间的对比度, 查看该容器 (参见图 2B)。在 0.5-5 帧/秒图像的船只。 在 0 mmHg 记录1分钟后, 通过关闭附加到加压套管的3路分路器将腔内压力增加到所需的水平 (见图 1B), 并通过注射器对系统施加少量的正压。观察压力表上的压强变化。注: 压力可以在一步明智的方式增加到 100 mmHg 或到一个价值例如 40 mmHg (近似视网膜动脉压力在体内)23。该船应迅速扩张确认成功插管。请注意, 压力引起的血管收缩 (i. e,肌力反应) 随后将发展15分钟, 但由于这些血管的体积小, 这可能并不总是视觉上可以检测到的。 在初始加压时仔细监测容器, 以明显泄漏。泄漏源可能来自于动脉的侧向分支或套管的密封不足。 注意离开血管的腔内内容。随着时间的推移, 随着压力的降低, 更小、更不明显的泄漏可能会变得明显。如果可能的话, 咬合用附加的钨丝卡瓦打开, 注意不要打扰套管。排除有明显渗漏的制剂进行进一步分析。 根据实验的目的 (前者允许对肌音的发展产生影响), 在 abluminally 之前或之后, 将感兴趣的药物应用于该容器上15分钟的增压, 而后者则能对效果进行分析。稳定状态的肌音)。典型的药物传递系统如图 3A所示。 将交货插座垂直于感兴趣的容器部分 (如图 1D所示), 距离500µm 远离感兴趣的容器, 以确保出口的最佳角度完全 superfuse 区域 (见图 3B)。确保灌注的变化不会在物理上扰乱血管。 实验完成后, 应用 0Ca2 +汉克斯10µM wortmannin (肌球蛋白轻链激酶抑制剂) 的解决方案, 最大限度地扩张血管以确定无源直径。注: 通过将腔内压力提高到 > 100 mmHg, 可以在实验结束时对插管密封的强度进行测试。即使在这个压力很大的情况下, 大部分船只仍会附着在密封处。 使用边缘检测进行离线分析以跟踪动脉直径的变化 (参见推荐软件的材料表)。将动脉直径标准化为无源直径, 以进行容器比较。 3. Ca2 +成像 注: 为常规 (microfluorimetry) 和共焦钙2 +成像 (使用材料表中详述的设备) 制备隔离视网膜动脉。 在5毫升玻璃试管中准备视网膜组织匀浆, 如1节所述。1毫升的视网膜匀浆添加 Fura-2AM (microfluormetric 钙2 +记录) 或 Fluo-4AM (共焦钙2 +成像), 使最终浓度5µM (保护免受光);染料指标优先加载到平滑肌细胞。 保持在室温下, 在黑暗中2小时, 每 15-20 分钟弹一边, 以重新暂停视网膜组织。此后, 用 LCH 溶液稀释匀浆 1:4, 以减少进一步的染料负荷。注: 船只仍可维持6小时 (储存在4摄氏度和黑暗中);但是, 建议尽快开始实验, 以减少染料在内部细胞器中的分裂作用, 或随着时间的推移染料的挤出。 将 1-2 毫升的视网膜匀浆转移到一个玻璃底记录室 (部分填充 LCH) 安装在与 Ca2 + microfluorimetry 或共聚焦显微系统相连的倒置显微镜的舞台上。 锚动脉垂直于整个记录室的流动方向, 钨线滑移 (50 µm 直径, 2-4 毫米长度) 间隔 ~ 100-200 µm 沿容器长度分开 (参见图 3C), 使用类似的技术来描述在步骤2.3 中。 灌注与正常的 Ca2 +汉克斯的解决方案在37摄氏度的浴缸。如图 3C所示, 放置药物递送插座, 并将药物应用于步骤2.17 所述的容器。 对于常规的 Ca2 +成像, 通过一个油浸泡紫外线目标 (如100X, NA 1.3), 通过光子计数光电倍增管 (PMT) 在 510 nm 处收集发射荧光, 以340/380 纳米光照射船只。 在每个实验结束时, 用含有 MnCl 的溶液淬火容器来测量背景荧光 (见表 1)。使用背景校正荧光比 (R-F340/F380) 进行分析或转换为胞内 Ca2 + ([Ca2 +]i) 使用 r最小和 r最大测量 (见表 1; 淬火前应用24) 和 Grynkiewicz 方程25。 对于共焦2 +成像, 激发 Fluo-4 加载的船只在 488 nm 和捕获的结果荧光发射在 490-535 nm 的任何线扫描模式 (xt) 或 xyt 扫描模式 (512 x 512 像素; 建议针孔 300 nm)。规范化测量的荧光记录在时间 t=0s (f/f0)。使用图像分析软件评估在药物应用期间 (Ca2 +]i中的任何变化, 或在特定感兴趣的区域 (ROIs) 中加压离线。 如果需要, 执行 Ca2 +成像与压力 myography。注: 以上描述已为非加压容器优化;然而, 可以将 Ca2 +成像与压力 myography 结合如下。 根据1节隔离动脉。负载与 Ca2 +指示染料按步骤 3.1-3.2。将微动脉转移到记录室, 并按2节 cannulate。在安装过程中要注意限制暴露在光线下。 根据上面的步骤3.5 或3.7 度量 Ca2 + 。对容器加压, 并重复测量 Ca2 +.同时测量容器直径取决于所使用的 Ca2 +测量和设备的模式。注: 对于共焦的 Ca2 +测量, 可能需要图像分开的区域前和后增压由于染料漂白的长期暴露于光。 4. 膜片钳电生理学 注: 全细胞和单通道记录是可能的个别动脉平滑肌细胞仍然嵌入在他们的父母动脉如下 (使用设备详细的材料表)。 如步骤1、2.3 和3.3 所述, 在记录室隔离和锚定视网膜微动脉。对于膜片钳记录, 钨线滑移间隔 200-800 µm 沿船分开。 去除动脉和电拆相邻平滑肌细胞和底层内皮细胞的基底层, 在贴片夹紧前。要做到这一点, superfuse 的容器与一系列的酶解 (表 1) 在37摄氏度的要求持续时间。注: 对大鼠视网膜小动脉 (蛋白酶, ~ 8 分钟, 胶原酶, ~ 12 分钟) 的酶暴露持续时间进行了优化, 并取决于药物输送系统的流速 (约1毫升/分) 和所用酶的单位活动。 评价胶原酶步骤中内皮和平滑肌层的视觉分离的消化水平, 如图 4所示。一旦观察到细胞层的分离 (如图 4B所示), 应用 DNAse I 溶液 (~ 4 分钟), 然后用正常的 Ca2 +汉克斯溶液取代浴液来终止消化。 通过仔细清扫沿容器表面的细钳闭合的尖端, 除去任何剩余的基板和/或外围 neuropile。 拉和抛光玻璃毛细血管 (材料表), 填充吸管溶液 (表 1), 并安全地放置在膜片钳 headstage 的吸管持有者。将吸管放置在45°角上, 与记录室相对应, 并使用机动机器人上的粗设置将其推进到容器上。 选择从血管壁凸出的平滑肌细胞, 其表面没有可见的碎片 (见图 4B)。将贴片吸管的尖端垂直放置在感兴趣的细胞上, 并逐渐降低, 使用机器人的细/慢运动与平滑肌膜接触。 通过在采集软件中使用膜 (密封) 测试协议 (5-10 mv 负步骤, 从 0 mv, 频率25赫), 从细胞运动的视觉上评估细胞和吸管之间的接触, 以及测量出的吸管阻力的变化; 见图 5A(i)). 当密封电阻增加5倍 (例如,从2上升到 10 MΩ;图 5A(ii)) 通过 y 形连接器、3路水龙头、注射器和导管附着在吸管托架上, 将负压瞬态应用于吸管支架的背面 (与在微动脉加压中使用类似的方式组装), 见图 1B)。 重复应用负压直到 gigaseal (> 1 GΩ电阻; 如在采集软件中的膜测试所示) 形成 (图 5A(iii))。注意, 这个过程可能需要 1-5 分钟。如果一个 gigaseal 无法形成, 选择一个不同的细胞修补钳使用新鲜的贴片吸管。 根据正在执行的实验 (通常为0、-40 或-80 mV), 通过采集软件对单元格应用保留电位。 在当前配置中研究 (单元格) 单通道活动。另外, 在 gigaseal 形成后, 通过快速缩回细胞表面的贴片吸管来产生内出斑块。 由于膜的自由端可以在这些条件下重新退火, 通过机械手的快速垂直运动 (粗设置) 将吸管从浴缸中取出。迅速返回通过半月板, 以去除改造后的膜只留下补丁内的吸管尖端。 将采集软件上的采样频率设置为5赫, 并激活连续记录模式以记录通道活动。应用任何电压变化, 如果需要通过软件或放大器。 如有需要, 如步骤2.17 所述, 将药物应用于容器/膜修补程序。 如果需要膜拉伸, 使用通过3路水龙头和 y 连接器连接到压力计的注射器, 对吸管的后部施加负压。 根据标准程序, 分析单通道记录的开放概率和酉电导率26。 对于整个细胞电流记录拉和抛光吸管根据材料表, 填充含有两性霉素 b 的吸管溶液 (添加3毫克的两性50µL 的二甲基亚砜; 将3-6 µL 添加到1毫升的全细胞吸管溶液中; 油脂实验混合)按步骤 4.6-4.9 形成密封。 由于两性霉素 B 的包含, 没有必要在吸管尖端的膜破裂, 以获得整个细胞的访问。监控接入, 将逐步获得, 使用膜测试协议在采集软件 (-20 mv 步骤从-40 mv, 采样频率25赫; 见图 5B)。 某些软件中电容瞬变的自动拟合产生了访问电阻和电池电容的实时测量 (或者, 瞬态的相对衰减可以用眼睛来评估)。一旦进入电阻降到 < 15 MΩ, 执行系列电阻补偿 (图 5C) 使用全细胞参数表盘 (电容和串联电阻) 的放大器。 为此, 请使用自动管接头值初始设置刻度盘 (请参见图 5C(ii)), 然后增加串联电阻补偿表盘 (如果放大器上有可用的预测和校正) 重新调整整个电池补偿同时减少电容瞬态 (见图 5C(iii))。 注意不要过度补偿 (如图 5C(iv) 所示)。通常, 有可能在穿孔补丁模式下对串联电阻进行75% 的补偿 (要求将滞后补偿设置在最大值)。 如果没有可用的自动管接头, 请首先将整个单元格参数拨为 15 pF 和 15 mΩ (这些单元格的典型值), 然后调整以生成输出, 如图 5C(ii) 所示。将系列电阻补偿表盘增加到 ~ 75%, 并根据图 5C(iii) 调整全单元参数刻度盘。 在开始试验之前, 请注意电池电容的测量, 无论是从最初的自动配件或从拨号后手动补偿。注意: 此值用于将电流正常化为单元格大小。对串联电阻的补偿可能需要在试验期间进行调整, 因为由于进一步将两性霉素 B 纳入修补程序, 进入可能会继续改善。 如步骤2.17 所述, 将药物应用于容器。根据实验要求应用电压协议 (步骤或坡道)。注: 典型的电压步进协议, 持续时间为 0.1-1 秒, 是从持有电位在 10-20 mV 增量每 5-十年代, 以产生一个家庭的电压激活电流。或者使用坡道协议来测量在一个 ‘ 扫 ‘ 的一系列电压的电流, 通过缓慢地将电压 (100-200 mv/秒) 从例如, -80 到 +80 mv (应用每 5-10 s) 与离线采样的电流在 10 mV 间隔期间在坡道。 可以将 Ca2 +成像与补丁钳录音相结合, 如下所示。根据1节隔离动脉。负载与 Ca2 +指示染料按步骤 3.1-3.2。按第4节装入记录室。在这些过程中, 注意限制暴露在光线下。注: 到目前为止, 由于在酶解离过程中基底膜和容器完整性的丧失, 使得膜片钳与压力 myography 研究无法结合