Isolamento delle arteriole retiniche per studi di fisiologia delle cellule Ex Vivo
1Centre for Experimental Medicine,Queen’s University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education),Queen’s University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy,Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences,Queen’s University of Belfast
Summary
Questo manoscritto descrive un semplice protocollo per l’isolamento delle arteriole dalla retina del ratto che può essere utilizzato in studi myography elettrofisiologici, imaging e pressione del calcio.
Abstract
La retina è un tessuto altamente metabolicamente attivo che richiede un rifornimento di anima sostanziale. La circolazione retinica supporta la retina interna, mentre i vasi coroideali forniscono i fotorecettori. Le alterazioni retiniche perfusione contribuiscono ad numerosi disordini avvistare-minaccioso, tra cui la retinopatia diabetica, glaucoma e ramo della retina occlusioni della vena. Comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nel controllo del flusso di sangue attraverso la retina e come questi sono alterati durante la malattia oculare potrebbe portare all’identificazione di nuovi bersagli per il trattamento di queste condizioni. Arteriole retiniche sono i vasi di resistenza principale della retina e di conseguenza, un ruolo chiave nella regolazione della retina emodinamica attraverso i cambiamenti di diametro luminal. Negli ultimi anni, abbiamo sviluppato metodi per isolare arteriole dalla retina del ratto che sono adatti per una vasta gamma di applicazioni, tra cui gli studi di fisiologia cellulare. Questa preparazione ha già iniziato a produrre nuove intuizioni come il flusso di sangue è controllato nella retina e ci ha permesso di identificare alcune delle principali modifiche che si verificano durante la malattia oculare. In questo articolo, descriviamo i metodi per l’isolamento delle arteriole retiniche di ratto e includere protocolli per il loro uso in elettrofisiologia di patch-clamp, calcio imaging e studi myography pressione. Questi vasi sono anche favorevoli per l’uso in PCR-, western blotting e immunohistochemistry-studi basati.
Introduction
Comprendere come viene controllato il flusso sanguigno nella retina è un obiettivo importante, poiché il flusso sanguigno anormale è stato implicato nella patogenesi di una varietà di avvistare-minacciosa malattie retiniche1,2,3, 4. La circolazione retinica, che fornisce i neuroni della retina interni e cellule gliali, ha un accordo di arteria di fine, con tutto il sangue dalle arterie retiniche e arteriole passando attraverso i capillari al venules retinici ed infine vene5. Flusso sanguigno nella retina è regolato dal tono delle arterie retiniche e arteriole, nonché l’attività contrattile dei pericytes poste sulle pareti dei capillari retinici e venule post-capillari6,7, 8. il controllo del tono vascolare retinica è complesso ed è modulato da una gamma di input dal sistema circolatorio e tessuto retinico circostante, compresi i gas del sangue, circolazione molecole e ormoni, e sostanze vasoattive rilasciato dal retiniche vascolari endotelio e macroglia9,10,11. Le arteriole retiniche sono i piccoli rami arteriosi della retina e sono composte da un singolo strato di cellule muscolari lisce vascolari e un rivestimento interno di disposti longitudinalmente cellule endoteliali12,13, 14. questi vasi formano il sito principale della resistenza vascolare all’interno della circolazione retinica e pertanto svolgono un ruolo importante nel controllo locale del flusso sanguigno retinico. Arteriole retiniche regolano il flusso sanguigno capillare nella retina di dilatazione o costrizione loro diametro luminal, mediato dai cambiamenti nel muscolo liscio vascolare contrattilità10,15,16. Comprensione dei meccanismi molecolari attraverso cui retinica arteriole regolano perfusione retinica richiede pertanto preparati dove le cellule di muscolo liscio arteriolare possono essere consultate e studiate in condizioni più vicino al fisiologiche possibile.
Ex vivo preparazioni dei vasi sanguigni retinici isolati forniscono accesso alle cellule muscolari lisce vascolari, pur mantenendo la loro funzionalità e l’interconnessione con l’endotelio sottostante. Maggior parte degli studi fino ad oggi utilizzando vasi isolati si sono concentrati sui grandi vasi arteriosi di specie bovine o suine (60-150 µm). Questi può essere montati a filo disponibile in commercio o sistemi di myograph di pressione per attivare farmacologico interrogatorio del muscolo liscio vascolare delle cellule contrattili meccanismi17,18. Tali preparazioni hanno contribuito notevolmente alla nostra conoscenza della fisiologia vascolare retinica in condizioni normali. Pochi studi hanno utilizzato arteriole retiniche isolati da piccoli animali da laboratorio come loro diametro più piccolo (~ 8-45 µm) impedisce l’utilizzo in sistemi convenzionali myography19,20,21,22. Un vantaggio importante, tuttavia, di utilizzare navi da piccoli animali da laboratorio è l’ampia disponibilità di modelli di malattia di organismi geneticamente modificati, transgenici e retinica. Piccoli animali da laboratorio sono anche più favorevoli per gli studi di intervento in vivo .
Qui descriviamo protocolli semplici per isolare e incannulamento arteriole retiniche di ratto per esperimenti myography pressione. CA2 + imaging ed elettrofisiologia protocolli utilizzando questi vasi sono anche dettagliati. Questi possono fornire ulteriori intuizioni nella regolazione della contrattilità del muscolo liscio vascolare e del flusso sanguigno nella retina.
Protocol
Tutti gli esperimenti descritti qui sono stati realizzati conformemente agli orientamenti contenuti all’interno del Regno Unito animali (procedure scientifiche) Act del 1986 e sono stati approvati presso la Queen University di Belfast sul benessere degli animali ed etici organo. 1. isolamento delle arteriole retiniche Nota: Il seguente protocollo viene utilizzato per isolare le arteriole retiniche. Questo metodo è ottimizzato per arteriole retiniche di ratto, ma può essere utilizzato con le retine del mouse. Il rendimento delle navi, tuttavia, è inferiore quando si utilizza il mouse. Costituiscono una soluzione di basso Ca2 + contenente Hanks’ (LCH) come mostrato in tabella 1.Nota: Questa soluzione può essere conservata fino a 3 giorni a 4 ° C (quando si utilizzano stored LCH, assicurarsi che esso equilibra a temperatura e il pH è corretto prima dell’uso). Assemblare le seguenti attrezzature prima della raccolta del tessuto per garantire la rapida microdissezione delle retine: seghettata pinze, forbici curve, dissezione piatto (siliconato di Petri), singolo taglio lama, 2 set di 1 vetro (smussato) forcipe pipetta Pasteur (lucidato a fuoco a una punta liscia ma non stretta), 1 pipetta di plastica monouso (con punta rifilata per aumentare l’apertura a ~ 5-7 mm), 1 bicchiere rotondo fondo provetta (5 mL) e titolare. Decantare circa 50 mL di ICL in un bicchiere di vetro e preparare un secondo Becher per decantare i rifiuti liquidi.Nota: Vedi Tabella materiali per specifiche e dettagli del produttore. Eutanasia il ratto usando CO2 seguita da puntura cardiaca a prosciugare (evitare la dislocazione cervicale o commozione cerebrale che può danneggiare i vasi sanguigni nell’occhio). Ritrarre le palpebre con il forcipe dentato, quindi utilizzare le forbici curve per tagliare intorno i muscoli orbitali e attraverso il nervo ottico. Estrarre delicatamente gli occhi dall’orbita avendo cura di tagliare attraverso eventuali allegati rimanenti con le forbici. Posizionare gli occhi immersi nella soluzione LCH sul piatto da dissezione (gli occhi possono essere trasportati sul ghiaccio in una soluzione di LCH se necessario). Utilizzare un set di pinze smussate per ancorare l’occhio al piatto tenendo il muscolo orbitale allegati o del nervo ottico; Assicurarsi che il punto di ancoraggio sia più vicino possibile allo sclera per stabilizzare l’occhio. Utilizzando la lama, tagliare attraverso la cornea lungo l’ ora serrata e rimuovere la lente premendo delicatamente sulla sclera con una pinza. Tagliare l’oculare a metà simmetricamente attraverso il disco ottico. Utilizzando chiuso forcipe delicatamente ‘spazzola’ fuori le retine dalle due metà di oculare avendo cura di togliere eventuali restanti allegati al disco ottico. Ripetere la procedura con il secondo occhio e trasferire le retine dissecate nella provetta utilizzando che la pipetta di plastica e una piccola goccia di mezzo LCH. Con la pipetta di plastica riempire la provetta con LCH a ~ 5 mL e consentire le retine a depositarsi sul fondo. Lavare il tessuto circa 3 volte rimuovendo ~ 4 mL di soluzione dal tubo e aggiunta di LCH fresco con la pipetta di plastica. Ove necessario, rimuovere il tessuto estraneo come legamenti sospensori, umore vitroso e peli. Lavare l’interno del vetro pipetta di Pasteur (lucido punta) con LCH per evitare che il tessuto si attacchi alla pipetta. Con la stessa pipetta, rimuovere circa 4 mL di soluzione dalla provetta. Quindi aggiungere circa 2 mL di LCH fresco. Delicatamente dissociare (triturare) le retine di disegno del tessuto attraverso la punta del vetro pipettare lentamente ed espellere il contenuto nella provetta. Si noti, non cercare di introdurre bolle in questa fase. Ripetere il passaggio 1.10 per le retine sono rotto fino a una dimensione di circa 2-3 mm2. Lavare l’interno della pipetta con circa 2 mL di LCH ed espellere questo nella provetta. Consentire il contenuto a stabilirsi nella parte inferiore di oltre il 5-10 min. Come delineato nella 1.10-1.12 con un po’ più forza fino a quando i pezzi di tessuto sono circa 1 mm2 dimensioni, ripetere il processo di triturazione. Ancora una volta, consentire al tessuto di accontentarsi di 5-10 min. Ripetere i passaggi da 1.10-1.12 una terza volta con più forza fino a quando i contenuti sono completamente omogeneizzati e non rimangano pezzi della retina (la soluzione dovrebbe diventare di aspetto lattiginoso).Nota: Questa tecnica consente di ottenere fino a 8 segmenti arteriolare (relativamente privo di circostante compresa e con alcuni rami rimasti intatti) per isolamento 8-45 µm di diametro e 200-2500 µm di lunghezza di misura. Trasferire una piccola quantità dell’isolato in una camera di registrazione fisiologica o aggiungere coloranti fluorescenti per la misura della concentrazione intracellulare di Ca2 + ([Ca2 +]i; vedere paragrafo 3). Smaltire i resti di conchiglie oculari e soluzione rimosso durante il processo di isolamento in conformità con le normative locali relative alla gestione dei rifiuti di origine animale.Nota: Mentre si consiglia di sperimentare sui vasi subito dopo l’isolamento, isolato del surplus possa essere memorizzato a 4 ° C per fino a 8 h. 2. arteriolare pressione Myography Nota: Pressione arteriolare myography viene effettuata come segue tramite apparecchio descritto in Figura 1A, B e la Tabella materiali. Trasferire un’aliquota dell’omogeneato vaso retinico (1-2 mL; isolato come previsto al punto 1) per una camera di registrazione fisiologica (parzialmente riempito con dimensioni nominali soluzione di Ca2 +gratis Hanks’; 0Ca2 + Hanks’; cfr. tabella 1) montato sul palco di un microscopio invertito. Lasciare i vasi a depositarsi sul fondo della camera di registrazione per almeno 5 min prima della sperimentazione. Visivamente attraverso la camera di registrazione per identificare arteriole > 200 µm in lunghezza e in possesso di un’estremità aperta attraverso la quale la nave può essere cannulata (identificazione del tipo di nave è ulteriormente esplorato nella sezione risultati). Posizionare il vaso al centro del campo visivo. Se nessun vasi adatti sono presenti, trasferire un’altra aliquota di omogenato di nave nella camera di registrazione ai sensi del punto 2.1. Fissa l’estremità della nave utilizzando una pinzetta e uno slittamento del filo di tungsteno piccolo (75 µm di diametro e ~ 2-4 mm di lunghezza) posto sopra la nave (Vedi Figura 1(i)). Per fare questo tenere il filo nel forcipe e individuare il forcipe sopra la camera di registrazione. Identificare l’ombra corrispondente delle pinze sotto il microscopio, abbassare il forcipe nel bagno fino a quando il filo diventa apparente. Posizionare il filo sopra la nave circa 200 µm dall’estremità aperta e rilasciare il filo perpendicolare all’asse longitudinale della nave.Nota: Il peso filo di tungsteno è sufficiente per occludere il vaso distalmente fermando il flusso di contenuto luminale durante l’inserimento di una canula e pressurizzazione. Spostare l’arteriola in posizione adatta all’interno della camera di registrazione in modo che esso si trova orizzontalmente attraverso il bagno con l’estremità aperta in linea con la cannula di pressurizzazione (Vedi Figura 1(ii-iv)). Per farlo, spingendo delicatamente lo slittamento di filo di tungsteno d’occlusione con un’ulteriore sezione del filo tenuto entro il forcipe; non toccare l’arteriola aderirà irreversibilmente dovettero usare il forcipe. Ove necessario (per segmenti lunghi arteriola), aggiungere ulteriori tungsteno filo scivola sopra la nave, tale che la distanza tra le estremità occluse e aperte della nave è non più di 200 µm; Questo aiuta a prevenire l’arteriola trasferirsi di fuori del campo visivo su di pressurizzazione. Se la nave è dotata di tutti i rami laterali, queste dovrebbero anche essere occluso con ulteriori tungsteno filo scivola. Se un ramo laterale non può essere occluso scartare la nave. Irrorare la camera con 0Ca2 + Hanks’ a 37 ° C per rimuovere tessuto retinico estraneo e per riscaldare il bagno a temperature fisiologiche.Nota: Un sistema di riscaldamento di aspersione e in linea bagno di gravità standard può essere utilizzato per questo scopo (Vedi Figura 1A). 0Ca2 + Hanks’ viene utilizzato per facilitare la procedura di inserimento di una canula, dalla rimozione di Ca esterna2 + garantisce che le arteriole rimangono dilatati. Fabbricare cannule di pressurizzazione da capillari di vetro borosilicato filamentato (punta diametro ~ 3-10 µm a seconda del diametro della nave per essere cannulati; vascelli più piccoli richiedono stretti cannule; veda la Tabella materiali) utilizzando una microelettrodo puller e retro-riempimento con soluzione 0Ca2 + Hanks’. Garantire che la tibia della cannula è affusolata delicatamente verso la punta per facilitare l’inserimento di una canula. Montare la cannula in un supporto di pipetta attaccato ad una siringa da 10 mL tramite un connettore a Y e rubinetto a 3 vie; Questo viene utilizzato per pressurizzare il sistema, la pressione viene registrato utilizzando un manometro collegato all’altro lato-braccio del connettore a Y (cfr. Figura 1B).Nota: Per semplificare il processo di inserimento di una canula è necessaria una pipetta ‘helper’. Fabbricare la pipetta da un capillare in vetro borosilicato tirato su un estrattore di microelettrodi per una punta di diametro di 0,5 – 2 µm. pesante fuoco polacco la pipetta (spesso fino a chiuso) utilizzando un microforge. Posizionare con cautela la pipetta di supporto perpendicolarmente all’asse lungo della nave vicino alla estremità aperta utilizzando un manipolatore meccanico 3 assi (Vedi Figura 1). Posizionare la pipetta di supporto appena sopra la nave, ma non toccarlo. Posizionare la pipetta di inserimento di una canula all’estremità aperta della nave (Vedi Figura 1 e 2A(i)) utilizzando un micromanipolatore bene; Posizionare la punta immediatamente adiacente all’apertura, come valutato regolando il piano di messa a fuoco il microscopio (a 20 X). Quando entrambe le estremità della nave e la punta della cannula sono a fuoco allo stesso tempo la cannula è posizionata correttamente per inserimento di una canula (Vedi Figura 2A(ii)). Fare avanzare la cannula di pressurizzazione nell’apertura vaso mediante i comandi dell’asse x del micromanipolatore bene (Vedi Figura 2A(iii)). Valutare il successo di inserimento di una canula spostando la cannula lungo l’asse y. Se la cannula rimane all’interno del vaso è correttamente cannulati (Vedi Figura 2A(iv)). Se la cannula si muove di fuori della nave, la cannula è probabile che sia di sopra della nave; in questo caso ripetere passo 2.10-2.11 con la cannula a un piano inferiore nell’asse z. All’inserimento di una canula successo abbassare delicatamente la pipetta di supporto sulla nave per trattenere l’arteriola. Guida della parete arteriolare sopra la cannula di pressurizzazione con la pipetta di supporto, allo stesso tempo come la pipetta di inserimento di una canula è avanzata ulteriore nel lume del vaso ad una distanza di circa 30-50 µm (Vedi Figura 2A(v, vi)).Nota: Questa procedura richiede movimento simultaneo, controllata di entrambi manipolatori (pipetta di supporto verso la cannula mentre la cannula si muove nel lume del vaso) e richiederà estesa pratica per raggiungere un alto tasso di successo. Modificare la soluzione del bagno normale Hanks contenente 2 mM Ca2 + (Vedi tabella 1) a 37 ° C. In genere questo provoca un restringimento lieve dell’arteriola e la formazione di una guarnizione stretta intorno la cannula di pressurizzazione. La pipetta di supporto può quindi essere spostata dalla nave. Consentire una perfetta tenuta sviluppare per 15 min. vista la nave utilizzando una fotocamera USB (e software di acquisizione delle immagini) collegato al microscopio e regolare la messa a fuoco per massimizzare il contrasto tra i confini di nave e gli spazi esterni e intraluminal (Vedi Figura 2B). Immagine della nave a 0.5 – 5 fotogrammi/s. Dopo 1 minuto di registrazione a 0 mmHg, aumentare la pressione intraluminal al livello desiderato, chiudendo il rubinetto 3 vie attaccato al cannula pressurizzazione (cfr. Figura 1B) e applicare una piccola quantità di pressione positiva al sistema tramite la siringa. Osservare la pressione cambia sul manometro.Nota: Pressione può essere aggiunto in modo passo saggio fino a 100 mm Hg o con un valore ad esempio 40 mmHg (approssimando pressione arteriolare retinica in vivo)23. La nave dovrebbe dilatare rapidamente confermando l’incannulamento di successo. Si prega di notare, vasocostrizione indotta da pressione (vale a dire, la valutazione della risposta miogenica) svilupperà successivamente per un periodo di 15 minuti, ma a causa delle piccole dimensioni di questi vasi, questo non può sempre essere visivamente rilevabile. Monitorare attentamente la nave durante la pressurizzazione iniziale per perdite evidenti. Fonti di perdita potrebbero originare da rami laterali spaccati o inadeguata tenuta della cannula all’interno dell’arteriola. Orologio per contenuto intraluminale lasciando la nave. Più piccole, meno evidenti perdite potrebbero diventare evidente nel corso del tempo come una caduta di pressione sul manometro. Se possibile, occludere l’apertura con tungsteno ulteriori slittamenti di filo facendo attenzione a non per disturbare la cannula. Escludere i preparativi con evidente perdita da ulteriori analisi. Applicare il farmaco di interesse abluminally il vaso prima di, o il seguente, pressurizzazione 15min a seconda degli obiettivi dell’esperimento (l’ex permette effetti sullo sviluppo del tono miogenico deve essere determinato, mentre quest’ultimo permette l’analisi degli effetti su tono miogenico allo steady-state). Un sistema di consegna di droga tipica è raffigurato in Figura 3A. Posizionare la bocca di mandata perpendicolare alla parte della nave di interesse (come illustrato nella Figura 1) ad una distanza ~ 500 µm dalla nave di interesse avendo cura di assicurare che la presa sia in modo ottimale angolato a completamente mantenere l’area (Vedi Figura 3B). Garantire che le modifiche nell’aspersione non disturbare fisicamente la nave. Dopo il completamento di un esperimento, applicare una soluzione di 0Ca2 + Hanks’ contenente 10 µM wortmannin (inibitore della chinasi della catena leggera di miosina) per dilatare al massimo la nave per determinare il diametro passivo.Nota: La forza del sigillo cannulazione può essere testata a conclusione dell’esperimento alzando la pressione intraluminale a > 100 mmHg. La maggior parte dei vasi rimarrà attaccata anche a questa alta pressione che indica una tenuta ermetica. Eseguire analisi non in linea utilizzando il rilevamento dei bordi per tenere traccia delle modifiche del diametro arteriolare (Vedi Tabella materiali per software suggerita). Normalizzare il diametro di arteriola al diametro passivo per il confronto tra navi. 3. Ca2 + Imaging Nota: Arteriole retiniche isolate sono preparati per convenzionale (microfluorimetry) e confocale Ca2 + imaging come segue (con apparecchio descritto in Tabella materiali). Preparare gli omogeneati retinici in una provetta di vetro 5ml come descritto nella sezione 1. Aggiungere ad 1 mL di omogenato retinica Fura-2 (microfluormetric Ca2 + registrazione) o Fluo-4 (Ca2 + formazione immagine confocal) per ottenere una concentrazione finale di 5 µM (proteggere dalla luce); indicatori di tintura caricare preferenzialmente in cellule di muscolo liscio. Mantenere a temperatura ambiente al buio per 2 h sfogliando il lato del tubo ogni 15-20 min per risospendere il tessuto retinico. Da allora in poi, diluire l’omogenato 1:4 con soluzione LCH per ridurre ulteriormente la tintura di caricamento.Nota: Le navi rimangono vitali per fino a 6 h (se conservato a 4 ° C e al buio); Tuttavia è consigliabile che gli esperimenti sono iniziati appena possibile per ridurre l’impatto di compartimentalizzazione della tintura in organelli interni o estrusione del colorante nel corso del tempo. Transfer 1-2 mL di omogenato retinica a una camera di registrazione con fondo in vetro (parzialmente riempita con LCH) montata sul palco di un microscopio invertito collegato ad un sistema di microscopia confocale o Ca2 + microfluorimetry. Ancorare le arteriole perpendicolare alla direzione del flusso attraverso la camera di registrazione, con slittamenti di filo di tungsteno (50 µm di diametro, 2-4 mm di lunghezza) distanziata ~ 100-200 µm lungo la lunghezza del vaso (Vedi Figura 3) utilizzando una tecnica simile a quella descritta al punto 2.3. Irrorare il bagno con la soluzione normale Ca2 + Hanks’ a 37 ° C. Posizionare la presa di consegna di droga come illustrato in Figura 3 e applicare farmaci ai vasi come descritto nel passaggio 2.17. Per convenzionale Ca2 + imaging, illuminare la nave con 340/380 nm luce tramite un obiettivo a immersione UV olio (ad es., 100 X, NA 1.3) e raccogliere la fluorescenza emessa a 510 nm tramite un fotone conteggio fotomoltiplicatore (PMT). Alla fine di ogni esperimento, misurare la fluorescenza di fondo estiguendo il recipiente con una soluzione contenente MnCl (Vedi tabella 1). Utilizzare rapporti di fluorescenza di fondo-rettificato (R-F340/F380) per analisi o convertire intracellulare Ca2 + ([Ca2 +]i) usando Rmin e misuremax R (Vedi tabella 1; applicato prima della tempra 24) e l’ equazione di Grynkiewicz25. Per Ca2 + la formazione immagine confocal, eccitare Fluo-4 caricato navi a 488 nm e cattura le emissioni di fluorescenza risultante a 490-535 nm in qualsiasi linea di scansione (xt) o i modi di scansione xyt (512 x 512 pixel; suggerito pinhole 300 nm). Normalizzare le misure alla fluorescenza registrata al tempo t = 0 (F/F0). Valutare eventuali cambiamenti in [Ca2 +]i durante le applicazioni farmacologiche o pressurizzazione offline in specifiche regioni di interesse (ROI) utilizzando software di analisi di immagine. Se necessario, esecuzione di Ca2 + imaging con pressione myography.Nota: Le descrizioni di cui sopra sono state ottimizzate per le navi non pressurizzate; Tuttavia è possibile combinare il Ca2 + imaging con pressione myography come segue. Isolare le arteriole come previsto al punto 1. Caricare con Ca2 + indicatore coloranti secondo passo 3.1-3.2. Trasferire le arteriole nella camera di registrazione e incannulare come previsto al punto 2. Prendersi cura di limitare l’esposizione alla luce durante la procedura di montaggio. Misurare Ca2 + secondo passo 3.5 o 3.7 sopra. Pressurizzare il vaso e ripetere la misurazione di Ca2 +. Misura simultanea di diametro del vaso dipende dalla modalità di Ca2 + misura e attrezzature utilizzate.Nota: Per misura2 + Ca confocale possono essere necessaria per pressurizzazione di regioni separate immagine in pre- e post-a causa di imbianchimento del colorante durante lunghe esposizioni alla luce. 4. Patch-Clamp elettrofisiologia Nota: È possibile registrare cellule intere e monocanale da cellule muscolari lisce arteriolari individuali ancora incorporate all’interno di loro arteriole genitore come segue (utilizzando l’apparecchio descritto in Tabella materiali). Isolare e ancorare arteriole retiniche nella camera di registrazione come descritto nei passaggi 1, 2.3 e 3.3. Per la registrazione di patch-clamp, il filo di tungsteno polizze sono spaziati 200-800 µm apart lungo la nave. Rimuovere la lamina basale che circonda l’arteriola e disgiungere elettricamente cellule di muscolo liscio adiacenti e sottostanti cellule endoteliali prima patch di bloccaggio. Per fare questo, mantenere il recipiente con una serie sequenziale di soluzioni enzimatiche (tabella 1) a 37 ° C per la durata richiesta.Nota: La durata dell’esposizione degli enzimi è ottimizzata per arteriole retiniche di ratto (proteasi, ~ 8 min; collagenosi, ~ 12 min) e dipende la portata del sistema di consegna di droga (~ 1 mL/min il nostro set-up) e le attività di unità del batch di enzimi utilizzati. Valutare il livello di digestione su separazione visiva dei endoteliale e strati di muscolo liscio durante la collagenosi passo come mostrato nella Figura 4. Una volta che la separazione degli strati delle cellule è osservato (come mostrato in Figura 4B), applicare dnasi ho soluzione (~ 4 min) quindi terminare la digestione da sostituzione della soluzione bagno con soluzione normale Ca2 + Hanks’. Rimuovere eventuali fili rimanenti di lamina basale e/o periferico compresa da spazzare accuratamente le punte chiuse di una pinzetta lungo la superficie del vaso. Tirare e lucidare tubi capillari in vetro (Tabella materiali), riempimento con soluzione pipetta (tabella 1) e posizionare in modo sicuro nel supporto pipetta dell’headstage di patch-clamp. Posizionare la pipetta ad un angolo di 45° rispetto alla camera di registrazione e farlo avanzare verso la nave utilizzando l’impostazione di massima su un micromanipolatore motorizzato. Selezionare una cella di muscolo liscio che sporge dalla parete del vaso e la cui superficie è libera da detriti visibili (Vedi Figura 4B). Posizionare il puntale della pipetta patch verticalmente sopra la cella di interesse e abbassare gradualmente usando il multa/lento movimento del micromanipolatore per fare contatto con la membrana del muscolo liscio. Valutare il contatto tra cella e pipetta visivamente dal movimento delle cellule e un cambiamento nella pipetta resistenza misurata utilizzando il protocollo di test di membrana (seal) nel software di acquisizione (passo negativo di 5-10 mV da 0 mV, frequenza 25 KHz; Vedi Figura 5A(i)) . Quando la resistenza di tenuta è aumentato 5 volte (ad esempio, passando da 2 a 10 MΩ; Figura 5A (ii)) applicare pressione negativa transitoriamente alla parte posteriore del supporto pipetta tramite un connettore a y, rubinetto a 3 vie, siringa e tubo collegato al titolare della pipetta (assemblati in un modo simile a quello utilizzato nella pressurizzazione delle arteriole, cfr. Figura 1B). Ripetere le applicazioni di pressione negativa fino a un gigaseal (> 1 resistenza GΩ; come indicato dal test del software di acquisizione della membrana) è formata (Figura 5A(iii)). Si noti che questo processo potrebbe richiedere 1-5 min. In caso di un gigaseal al modulo, scegliere un’altra cella a toppa morsetto utilizzando una pipetta patch fresco. Applicare una partecipazione potenziale della cella tramite il software di acquisizione secondo l’esperimento viene eseguito (in genere 0, -40 o -80 mV). Attività di canale singolo studio (il cellulare) nella configurazione attuale. In alternativa, è possibile generare patch di dentro-fuori ritraendo rapidamente la pipetta patch dalla superficie delle cellule dopo la formazione di gigaseal. Come le estremità libere della membrana possono ri-Tempri in queste condizioni è possibile rimuovere la pipetta dalla vasca tramite rapido movimento verticale del manipolatore (regolazione grossolana). Ritornano rapidamente attraverso il menisco per rimuovere la membrana riformata, lasciando solo la patch all’interno la punta della pipetta. Impostare la frequenza di campionamento sul software di acquisizione a 5 KHz e attivare la modalità di registrazione continua a registrare canale attività. Applicare le modifiche di tensioni se richiesto tramite il software o l’amplificatore. Se richiesto, è necessario applicare farmaci alla nave/membrana patch come descritto nel passaggio 2.17. Se tratto di membrana è necessario, applicare una pressione negativa la faccia posteriore della pipetta utilizzando la siringa collegata ad un manometro tramite un rubinetto a 3 vie e un connettore a y. Analizzare le registrazioni del singolo canale per probabilità aperta e conduttanza unitaria secondo procedure standard26. Per tutta la cella corrente registrazione pipette pull e polacco secondo la Tabella materiali, riempire con la pipetta soluzione contenente amfotericina B (3 mg di amfotericina B aggiungere 50 µ l di DMSO; aggiungere 3-6 µ l di questo in 1 mL di soluzione di cellule intere pipetta; trattare con ultrasuoni per mescolare) e formare un sigillo come da procedura 4.6-4.9. A causa dell’inclusione di anfotericina B non c’è nessun bisogno di rottura della membrana all’interno la punta della pipetta per accedere a cellula intera. Monitorare l’accesso, che sarà acquisita gradualmente, utilizzando il protocollo di test di membrana del software di acquisizione (passo mV-20 da -40 mV, frequenze di campionamento di 25 KHz; Vedi figura 5B). Raccordo automatico capacitivo transitori in alcuni software produce misurazioni in tempo reale di accesso resistenza e la capacità delle cellule (in alternativa il relativo declino dei transitori può essere valutato dall’occhio). Una volta che la resistenza di connessione scende a < 15 MΩ, effettuare compensazioni di resistenza di serie (Figura 5) utilizzando le manopole di parametro intero-cellula (serie della capacità e della resistenza) dell’amplificatore. Per effettuare questa operazione, utilizzare i valori di montaggio automatizzato per impostare inizialmente i quadranti (vedere Figura 5(ii)), quindi aumentare il quadrante di compensazione resistenza di serie (stima e correzione se disponibile sull’amplificatore) ri-regolare le compensazioni a cellula intera riducendo il capacitivo transitorio (Vedi Figura 5(iii)). Facendo attenzione a non per sopra compensare (come mostrato in Figura 5(iv)). In genere, è possibile compensare la resistenza in serie del 75% in modalità di patch perforata (richiede compensazione del lag da impostare al massimo). Se nessun adattamento automatico è disponibile, avviare impostando i parametri di cellule intere quadranti a 15 pF e 15 mΩ (valori tipici per queste cellule) e quindi regolare per produrre gli output come mostrato in Figura 5(ii). Aumentare il quadrante di compensazione serie resistenza al ~ 75% e riadattare i quadranti di cellule intere parametri come da Figura 5(iii). Prima di iniziare la sperimentazione nota la misura della capacità delle cellule il primo adattamento automatico o dal quadrante dopo compensazione manuale.Nota: Questo valore è utilizzato per normalizzare le correnti per dimensioni della cella. Compensazione per la resistenza di serie potrebbe essere necessario essere regolato durante la sperimentazione come accesso può continuare a migliorare a causa di ulteriore incorporazione di anfotericina B nella patch. Applicare farmaci ai vasi come descritto nel passaggio 2.17. Applicare protocolli di tensione (gradini o rampe) secondo i requisiti sperimentali.Nota: Protocolli di passaggio tensione tipica, 0,1 – 1 s in durata, vengono applicate dall’azienda potenziale in 10-20 mV incrementa ogni 5-10 s per produrre una famiglia di correnti tensione-attivato. In alternativa utilizzare protocolli di rampa per misurare correnti presso una serie di tensioni in una ‘sweep’ di dilagare la tensione lentamente (100-200 mV/s) da es. -80 a + 80 mV (applicato ogni 5-10 s) con campionamento in linea della corrente a intervalli di 10 mV durante la rampa. È possibile combinare il Ca2 + formazione immagine con patch-clamp registrazione come segue. Isolare le arteriole come previsto al punto 1. Caricare con Ca2 + indicatore coloranti secondo passi 3.1-3.2. Montare nella camera di registrazione ai sensi dell’articolo 4. Prendersi cura di limitare l’esposizione alla luce durante queste procedure.Nota: A tutt’oggi non è stato possibile combinare patch-clamp con studi myography di pressione a causa della perdita della membrana dello scantinato e l’integrità della nave durante il processo di dissociazione enzimatica
Representative Results
Figura 6A viene illustrato lo schema di massima dell’albero vascolare retinico del ratto. Il diametro varia di primo ordine (30-45 µm), secondo ordine (20-30 µm) e arteriole pre-capillari (8-20 µm) è stata confermata sperimentalmente nel nostro laboratorio di imaging confocale di ratto retinico intero-monta le preparazioni immunohistochemically etichettati per l’actina del muscolo liscio come α (Figura 6B). Al momento di dissociazione della retina, arteriole primari, secondari e pre-capillare possono essere identificati basato su loro calibro e la disposizione delle cellule muscolari lisce. Le arteriole di primo e secondo ordine appaiono visivamente simili nell’ambito di microscopia in campo chiaro, ma possono essere distinte in base al loro formato (Figura 6). Le arteriole pre-capillari sono i vasi arteriosi più piccoli nella preparazione e sono facilmente riconoscibili grazie alla loro disposizione sparser delle fibre muscolari lisce. Le arteriole isolate possono essere chiaramente differenziate da capillari e delle venule entro l’isolamento. I capillari sono evidenti come un reticolo di vasi di piccolo calibro (4-10 µm di diametro), mentre venule sono sottili con pareti e mancanza di copertura cellulare del muscolo liscio (Figura 6). Primarie, secondarie e pre-capillare arteriole sono adatti per pressione myography, Ca2 + imaging e patch-clamp studi. La figura 7 Mostra un esperimento myography pressione dove ha stato cannulato un’arteriola retinica del ratto primario e la pressione intraluminal sollevata a 40 mmHg. L’arteriola è quindi mantenuto a questa pressione per consentire lo sviluppo di tono miogenico prima dell’aggiunta di 0Ca2 + Hanks’ contenente 10 µM wortmannin per ottenere il diametro passivo della nave. Figura 7A Mostra microfotografie dell’arteriola in vari momenti nel corso dell’esperimento. Un record di corso a tempo pieno che mostra i cambiamenti nel diametro del vaso nel corso del tempo sono state disegnate in figura 7B utilizzando custom made-rilevamento dei bordi software27. Immediatamente dopo la pressurizzazione dilata la nave, che è poi seguita da una costrizione myogenic attivo che raggiunge un livello stazionario dopo 15 min. aggiunta di 0Ca2 + Hanks’/ soluzione wortmannin dilata la nave torna a un livello simile a quello osservato immediatamente dopo la fase di pressione iniziale. Come descritto in precedenza, droghe possono essere applicati per i vasi prima o pressurizzazione seguente per studiare i meccanismi alla base lo sviluppo e il mantenimento del tono miogenico in questi vasi. Utilizzando questo approccio, abbiamo precedentemente dimostrato che tratto-attivato canali Transient Receptor potenziali vanilloidi 2 (TRPV2) e L e T-tipo scanalature tensione-gated Ca2 + giocano un ruolo centrale nel facilitare lo sviluppo di tono miogenico in primo e secondo ordine ratto arteriole retiniche20,21,22. Abbiamo anche segnalato che grande conduttanza Ca2 + attivato potassio canali (canali BK)19,28 e K divin contenenti 1 tensione-gated atto canali K+ di opporsi myogenic attività in questi vasi, dato che l’aggiunta di inibitori specifici per ciascuno di questi canali provoca vasocostrizione (Figura 7). Figura 8 Mostra esempi di convenzionale e confocale Ca2 + imaging in arteriole retiniche prima e dopo l’esposizione al peptide vasocostrittore, endotelina-1 (Et-1). In registrazioni convenzionali basati su fura-2 (Figura 8A), Et-1 (10 nM) suscita un aumento bifase in [Ca2 +]io in strato del muscolo liscio arteriolare retinica, che comprende una componente transitoria iniziale seguita da una più bassa sostenuta componente. Precedentemente abbiamo caratterizzato i componenti transitori e sostenuti come essendo dovuto il rilascio di Ca2 + dal reticolo endoplasmatico e afflusso di Ca2 + dallo spazio extracellulare, rispettivamente29. Fluo-4-base di Ca2 + formazione immagine confocal fornisce un quadro più dettagliato degli effetti di Et-1 a livello cellulare. In questi esperimenti, è evidente che il liscio classificato globale [Ca2 +]ho osservato nel nostro risultato di studi microfluorimetry da Et-1 stimola l’attivazione di ripetitivo asincrona [Ca2 +]i cambiamenti oscillazioni nelle cellule del muscolo liscio arteriolare retinica vicini lungo la parete del vaso (Figura 8B, C; 30). Figura 9 Mostra esempi di registrazioni di morsetto patch monocanale e cellule intere da cellule muscolari lisce arteriolari retiniche. Fin qui, abbiamo effettuato sia su cellule e dentro-fuori canale singolo patch morsetto registrazioni22,28. Figura 9A, B, ad esempio, Visualizza un su-cellula patch clamp registrazione prima di e il seguente tratto di membrana (generati applicando pressione negativa per la pipetta patch). Questo particolare patch contiene due canali che vengono attivati da stiramento meccanico. Precedentemente abbiamo dimostrato che queste correnti possono essere inibite mediante TRPV2 canale poro-blocco anticorpi22. La conduttanza unitaria dei canali (249,71 pS) è inoltre coerenza con queste correnti che sono mediate da TRPV231. Le correnti tensione-attivato cellule intere possono essere evocate utilizzando protocolli di passaggio di tensione. Figura 9 Mostra una famiglia di tensione-attivato tipo K+ correnti registrate utilizzando un approccio di questo tipo. Queste correnti diventano evidenti quando altri grandi correnti presentano in queste cellule (ad es., BK e Ca+-attivato correnti Cl– ) sono bloccati utilizzando specifici agenti farmacologici32,33. Correnti attraverso canali ionici voltaggio-dipendenti non induttivi o debolmente in genere vengono esaminate utilizzando protocolli di rampa di tensione. Abbiamo usato tali protocolli per identificare e caratterizzare le correnti TRPV2 attivate da ipotonico elasticizzato22 e canale agonisti (Figura 9) nelle cellule muscolari lisce arteriolari retiniche. La figura 10 Mostra la doppia pressione myography e Ca2 + formazione immagine confocal applicato in un’arteriola retinica del ratto primario. Frequenza aumentata di trigger di pressurizzazione di [Ca2 +]i oscillazioni nelle cellule muscolari lisce individuali simili a quelli osservati con Et-1. Precedentemente abbiamo indicato che queste oscillazioni vengono attivate dalla sommatoria di Ca2 + scintille (localizzata Ca2 + rilascio eventi) e contribuiscono alla generazione di tono miogenico20. Figura 1 . Messa a punto sperimentale per pressione myography in arteriole retiniche ratto. A) attrezzature sperimentali tra cui microscopio invertito, riscaldatore in linea per vasca perfusato, 3 assi meccanici e micro-manipolatori, manometro, titolare della cannula e tavolo air. B) diagramma schematico che mostra la disposizione ottimale della pipetta e sul vaso di interesse nella camera di registrazione cannulating. Questo diagramma illustra anche l’assetto base degli impianti di pressurizzazione. C) diagramma schematico illustrato il processo di ancoraggio e l’utilizzo di liste di filo di tungsteno ulteriori tenute a forcipe fine la nave in movimento. (i) goccia 1st slittamento per occludere il vaso. (ii, iii) Utilizzare ulteriori slittamenti per assestare l’occludendo slittamento (direzione indicata dalla freccia) e che accompagna la nave nell’orientamento ottima indicato nel (iv). D) diagramma schematico che mostra il posizionamento ottimale di occlusione slittamento del filo di tungsteno, supporto pipetta e cannula in relazione alla nave come organizzato prima dell’inserimento di una canula. L’uscita del sistema di consegna della droga è posizionata ad una distanza di ~ 500 µm dal vaso per ridurre gli artefatti di movimento durante l’applicazione del farmaco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 . Processo di inserimento di una canula per pressione myography. A) microfotografie mostrando un’arteriola retinica ancorato giù nella camera di registrazione prima del (i), durante (ii)-(v) e inserimento di una canula seguente (vi). Freccia blu indica la direzione del movimento della cannula mentre la freccia verde indica la direzione del movimento della pipetta helper. Microfotografia di B) che evidenzia la regione ottima per la registrazione di attività miogenico durante la pressurizzazione come evidenziato in rosso. Nota, regolazione della luce e messa a fuoco per aumentare il contrasto delle pareti del vaso consente meglio di rilevamento dei bordi di vasi per l’analisi automatizzata. Barra della scala indica 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 . Consegna della droga. A) attrezzature utilizzate per il drug delivery risultati serbatoi soluzione collegati ad un collettore di consegna multicanale controllato da rubinetti a 3 vie e collegato a un manipolatore meccanico 3 assi. B) schema l’ottimale posizionamento verticale di drug delivery collettore in relazione alla camera di registrazione. Microfotografia di C) di una nave ancorata giù nella camera di registrazione che mostra il posizionamento ideale della bocca di mandata di droga. Barra della scala rappresenta 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 . Digestione enzimatica delle arteriole retiniche per toppa morsetto registrazione. Micrografie di un’arteriola retinica prima (A) di luce e dopo digestione enzimatica (B). Si noti la separazione fisica (indicata dalle frecce) di cellule di muscolo liscio (SMCs) dalle cellule endoteliali sottostante (ECs). Cellule di muscolo liscio adatte per patch di bloccaggio sono indicate con un asterisco. Barra della scala rappresenta 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 . Singolo canale e la cellula intera patch clamp registrazione. A) illustrazione delle correnti prova osservata durante il protocollo ‘prova di tenuta’ quando: (i) la pipetta patch entra il mezzo bagno esterno, (ii) la punta della pipetta entra in contatto con la membrana plasmatica delle cellule muscolari lisce vascolari e (iii) di aspirazione è applicato sul retro della pipetta per consentire la formazione di gigaseal. A seguito di compensazione di capacitanza pipetta utilizzando l’amplificatore di patch clamp, correnti di singolo canale ora possono essere registrate nella configurazione su cellulare o una patch della membrana può essere asportata rapidamente ritirando la pipetta per creare una patch di ‘inside-out’. B) le modifiche correnti associate con lo sviluppo di accesso elettrico all’interno delle cellule durante l’applicazione di cellule intere l’anfotericina B perforato patch clamp tecnica (i): (ii) come accedere a partizioni di amfotericina B nella membrana, Cascate di resistenza e transitori di capacitanza ha suscitati durante hyperpolarizing passaggi di tensione (da -40 a -60 mV) diventano più grandi; (iii) una volta accesso resistenza (Run) è caduto a < 15 MΩ, che prende di solito 5-10 min in seguito gigaseal formazione, sperimentazione è possibile. C) prima della registrazione di cellule intere, accesso resistenza e capacità di cella deve essere compensato usando i quadranti rilevanti sull’amplificatore patch clamp. Valori di capacità di resistenza e cella di accesso fornito da funzioni automatiche all’interno del software di patch-clamp possono essere utilizzati per aiutare a guidare questo processo: (i) indica la capacità transitorio prima della compensazione prelevati dalla regione evidenziata in B(iii); (ii) Mostra la riduzione la capacitanza transitoria normalmente osservati quando l’accesso resistenza e capacità sono compensati; (iii) compensazione della resistenza serie quindi dovrebbe essere corretto fino al 75% e accesso resistenza e compensazioni di capacitanza messo a punto tale che il transitorio risultante dovrebbe essere relativamente uguale in ampiezza sopra e sotto il livello di altopiano della corrente durante il passo. (iv) dovrebbe prestare attenzione a garantire che la resistenza di accesso non è più compensata (indicato dalla presenza di ‘suonare’ del transitorio), che può verificarsi a volte se l’accesso continua a migliorare nel corso dell’esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 . Identificazione delle arteriole retiniche isolati del ratto. A) illustrazione che mostra la disposizione dell’albero microvascolari della retina del ratto. B) immagini Confocal di arteriole retiniche di ratto e venules all’interno piatto monta le preparazioni hanno macchiato per αSMA (rosso; nuclei sono macchiati blu; barre della scala rappresentano 50 µm). C) luce micrografie di isolato 1 °, 2 ° e arteriole pre-capillari, una rete capillare e venula (barre della scala rappresentano 10 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7 . Le registrazioni myography pressione arteriolare. A) le immagini di una mostra di cannulate arteriola retinica (i) a riposo diametro (circa 35,6 µm) e (ii) la dilatazione al momento di pressurizzazione, (iii) sviluppo di myogenic vasocostrizione e dilatazione (iv) grazie all’aggiunta di 10 µM wortmannin in 0Ca2 + Soluzione di hanks’. Scala bar rappresenta 10 µm. B) grafico tempo corso di diametro del vaso per l’esperimento completo mostrato nella A (campionata a 2,5 fotogrammi/s). C) diametro di traccia da un diverso arteriola sotto tono miogenico allo steady-state (µm di diametro 38,7) mostrano gli effetti della correolide di inibitore di canale Kv1 (10 µM) e il BK canale inibitore iberiotoxin (100 nM) (campionata a 0,5 fotogrammi/s). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8 . Effetti di Et-1 su [Ca2 +] ho Segnalazione attività in arteriole retiniche di ratto. A) convenzionali basati su fura-2 registrazione mostrano gli effetti di Et-1 (10nM) su globale [Ca2 +]i. Basale [Ca2 +]mi è stato di 82 nM nell’arteriola 1 °. B) basato su Fluo-4 confocale xt immagini mostrano gli effetti di Et-1 [Ca2 +]io a livello cellulare. C) trama dell’intensità di fluorescenza normalizzata (F/F0) misurata in cellule come indicato in B. Questa figura è stata modificata da Tumelty et al. 30 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9 . Singolo canale e registrazioni di cellule intere patch-clamp da cellule muscolari lisce arteriolari retiniche del ratto. A, B) registrazioni monocanale su cellula dalla membrana stessa patch prima (A) e nei periodi (B) l’applicazione di pressione negativa (-45 mmHg) alla patch pipetta. Due canali sono presenti nella patch (unitario corrente 12,81 pA; Conduttanza unitaria 249.71 pS) che mostrano un aumento sostanziale nell’attivazione in condizioni di stiramento. Regioni selezionate da pannelli superiori (i) vengono visualizzate su un tempo più veloce base in pannelli inferiore (ii). C) famiglia delle correnti del canale di tipo A-K+ (i) registrato in modalità intera cellula in presenza di inibitori di BK e Ca2 +-attivato inibitori di canali Cl– , ha suscitati in risposta ad incrementi di 20 mV tensione tra -80 mV a + 80 mV (ii). Correnti di tutta la cella D) (i) suscitate da rampe di tensione tra -80 mV e + 80 mV prima (linea nera) e durante l’applicazione (linea rossa) del TRPV2 canale agonista delta-9-tetraidrocannabinolo (Δ9-THC). Il protocollo di rampa di tensione utilizzato viene visualizzato nel pannello inferiore (ii). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 10 . Ca2 + confocale imaging prima di e dopo la pressurizzazione di un’arteriola retinica ratto. Scansioni di xt confocale rappresentante (i) di cellule di muscolo liscio arteriolare retinica sotto (A) in assenza di pressione e (B) sotto pressione condizioni ottenute da regioni separate della nave stessa. (ii) cambia in fluorescenza normalizzata (F/F0) registrato in singole celle a – e, come indicato al punto (i), tramato contro il tempo. Gli asterischi indicano singoli subcellulare Ca2 + scintille che aumentare di frequenza dopo pressurizzazione e sommare per innescare cellulare Ca2 + le oscillazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Composto (mM) Basso Ca2 + Hanks’ 0Ca2 + Hanks’ Hanks, normale Enzima della proteasi di isolamento Enzima collagenasi di isolamento Enzima di isolamento dnasi Placare la soluzione Rmin soluzione Soluzione di Rmax Cella associata soluzione extracellulare Soluzione di pipetta collegata alla cella Soluzione extracellulare della intero-cellula Soluzione di cellule intere pipetta Purezza dell’acqua (resistenza) ≥ 15 MΩ.cm ≥ 15 MΩ.cm ≥ 15 MΩ.cm ≥ 15 MΩ.cm ≥ 15 MΩ.cm ≥ 15 MΩ.cm ≥ 15 MΩ.cm ≥ 15 MΩ.cm ≥ 15 MΩ.cm ≥ 15 MΩ.cm ≥ 18 MΩ.cm ≥ 15 MΩ.cm ≥ 18 MΩ.cm NaCl 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140 kCl 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 138 D-glucosio 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 MgCl2 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1 HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 CaCl2 0.1 2 0.1 0.1 0.1 10 2 2 2 0.2 EGTA 4 0,5 MnCl 10 Ionomicina 0,01 KOH 140 130 Acido D-gluconico 130 130 NaOH 10 Penitrem A 0,0001 0,0001 0,0001 4-aminopiridina 10 Nimodipina 0,01 0,01 Fluoxetine 0.1 acido 9-anthracenecarboxylic 1 Amfotericina B 300-600 μg mL-1 Tipo di proteasi XIV ~0.01% (0,4-0,6 mg/40 mL) Collagenasi tipo 1A 0,1% (6 mg/60 mL) Dnasi I 20 KU (20 μL di 1 MU/mL di brodo in 20 mL) pH 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.2 titolato con NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH Tris Tris NaOH KOH Tabella 1. Composizione di soluzioni utilizzati nella sperimentazione, inclusi esempi di esterni e pipetta soluzioni utilizzate per singolo canale (TRPV2) e cellule intere correnti (tipo a).
Discussion
I protocolli sopra descritti richiedono pratica ma dovrebbero essere realizzabili con minima risoluzione dei problemi. In un giorno medio vorremmo ottenere 6-8 arteriole utilizzabile dall’isolamento e realizzare esperimenti di successo 3-4. Se si verificano problemi, tuttavia, ci sono alcuni passaggi che possono essere adottate per contribuire a migliorare le percentuali di successo. Occasionalmente abbiamo trovato, soprattutto quando si usano più giovani ratti (< 8 settimane), che il rendimento delle arteriole può essere basso. Per aggirare questo problema, vi suggeriamo di centrifugazione del tessuto retinico (10-30 s a 500 x g) tra ciascuno della triturazione passi nei passaggi 1.12-1.14. Questo spesso aiuta a migliorare il rendimento delle navi, ma aumenterà anche la quantità di detriti cellulari all'interno della preparazione.
Quando incannulamento vasi per studi myography pressione è importante controllare le arteriole attentamente per eventuali rami laterali che si possono avere stati spaccati vicino al sito di biforcazione. Questo rappresenta una causa comune di perdita e la perdita di pressione durante la sperimentazione. Il problema principale che possa sorgere con il [Ca2 +]i protocolli è il livello della tintura di caricamento. Caricamento di povero tintura porta a bassi rapporti segnale-rumore, pur sovraccaricare risultati interruzione del normale omeostasi del Ca2 + . Per ridurre la probabilità di uno di questi problemi, una piccola aliquota dell’omogeneato retinica può essere rimosso, e vasi isolati controllato periodicamente durante il protocollo di carico. Quando esperimenti di impresa patch-clamp, il tasso di successo di gigaseal formazione è altamente dipendente da come ben la lamina basale è stata digerita. Quando inizialmente questo protocollo di analisi o utilizzando un nuovo sacco di enzimi può essere necessario regolare la concentrazione/durata della digestione degli enzimi. Monitorare attentamente la separazione degli strati endoteliali e muscolari lisce garantirà digestione sufficiente rimuovere abbastanza basale laminare per ottenere l’accesso. Attento monitoraggio è anche necessario per evitare sovra-digestione, che può manifestarsi come la nave comincia a restringersi. In questo caso, le cellule di muscolo liscio sono spesso troppo fragile per la registrazione di patch clamp. Quando l’applicazione di enzimi, è importante includere dnasi io per garantire la rimozione di filamenti di DNA liberati dalle cellule danneggiate durante il processo di isolamento. Frammenti di DNA sono appiccicosi e causare il forcipe rispettare l’arteriola durante le fasi finali del processo di pulizia (punto 4.4), spesso con conseguente perdita del vaso. Pulizia dei vasi è tecnicamente difficile e migliore viene eseguita ad alto ingrandimento (X 20) con movimenti delicati di spazzamento di pinze chiuse del diametro della punta possibili migliore. Tra spazza, pulire le pinze con rotolo di laboratorio.
Come evidenziato in precedenza, una motivazione chiave dietro lo sviluppo dei protocolli descritti in questo manoscritto era capire meglio perché il flusso sanguigno è interrotto durante malattie vascolari retiniche. La maggior parte del nostro lavoro fino ad oggi si è concentrata sulla malattia dell’occhio diabetica28,33. Arteriole possono essere isolati da retine dei modelli sperimentali del roditore del diabete utilizzando i metodi descritti nella sezione 1. Quando sperimentando su arteriole retiniche isolati dagli animali diabetici, è importante cercare di replicare strettamente le condizioni hyperglycemic vissute dai vasi in vivo. Per questo motivo, abbiamo normalmente sarebbe aumentare i livelli di D-glucosio nel nostro isolamento e soluzioni sperimentali a 25 mM. Ispessimento delle membrane dello scantinato vascolare è un fenomeno incontestato in vasi retinici durante diabete34,35. Quando si utilizza animali con diabete prolungata (> 1 mesi di durata di malattia), le concentrazioni dell’enzima aumentata o tempi di digestione sono spesso necessarie per consentire all’applicazione di metodi di registrazione di patch-clamp.
Un’importante limitazione dell’utilizzo di ex vivo isolato arteriole retiniche a studiare fisiologia vascolare retinica e patofisiologia è la perdita della compresa retinico circostante. Anche se la rimozione delle cellule gliali e neuronali della retina consente un facile accesso per le cellule di muscolo liscio vascolare retinica per gli studi di fisiologia cellulare, la risposta dei vasi di mediatori vasoattivi possa cambiare drasticamente in assenza e in presenza di retinale tessuto. Le azioni di adenosina tri-fosfato (ATP), ad esempio, forniscono un buon esempio di questo punto. In isolati ratto arteriole retiniche, aggiunta di ATP trigger una robusta costrizione dei vasi36, mentre si è in presenza di un intatto compresa, i vasi si dilatano37. Pertanto, ove possibile, cerchiamo di solito convalidare i risultati chiave da nostri preparativi arteriola isolato utilizzando ex vivo retinica tutta-monti e in vivo misure di vaso diametro e sangue flusso16,37 . Della nota, nuovi metodi recentemente sono emerso per studiare piccole arteriole e capillari in tutto irrorato porcina retine ex vivo38,39. Tali preparazioni sono suscettibili di migliorare notevolmente la nostra comprensione di come il compresa retinica regola il tono arteriolare e capillare retinico e come cambiamenti in emodinamica retinica modulano l’attività neuronale nella retina.
Anche se le procedure descritte in questo documento sono focalizzate sull’utilizzo delle arteriole retiniche isolati del ratto per fisiologia cellulare del muscolo liscio arteriolare di comprensione, attualmente stiamo sviluppando protocolli per attivare anche lo studio della funzione endoteliale delle cellule in questi vasi. Nel lavoro preliminare, siamo riusciti a modificare la digestione enzimatica dei segmenti arteriolare retiniche per produrre tubi di vitali delle cellule endoteliali che sono suscettibili di Ca2 + imaging e patchclamp studi di registrazione. Inserimento di una canula delle arteriole isolate ad entrambe le estremità, abilitazione intraluminal consegna delle droghe, in futuro potrebbe anche enable endotelio-dipendente risposte vasodilatatori ad essere studiati in questi vasi.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sviluppo dei protocolli descritti in questa carta è stato sostenuto da sovvenzioni dalle seguenti agenzie di finanziamento: BBSRC (BB/I026359/1), lotta per vista (1429 e 1822), The Juvenile Diabetes Research Foundation (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (STL/4748/13) e MRC (MC_PC_15026).
Materials
| Beakers | Fisherbrand | 15409083 | Or any equilavent product |
| Curved Scissors | Fisher Scientific | 50-109-3542 | Or any equilavent product |
| Disposable plastic pipette/ transfer | Sarstedt | 86.1174 | 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture |
| Dissecting microscope | Brunel Microscopes LTD | Or any equilavent product | |
| Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 14095 | Any equivalent fine forceps |
| Pasteur pipette | Fisherbrand | 11546963 | Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | P7741 | Or any equilavent 10cm product |
| Pipette teat | Fisherbrand | 12426180 | Or any equilavent product |
| Purified water supply | Merek | Milli-Q Integral Water Purification System | Or any equilavent system |
| Round bottomed test tube | Fisherbrand | 14-958-10 B | 5 mL; any equilavent product |
| Seratted forceps | Fisher Scientific | 17-467-230 | Or any equilavent product |
| Single edge blades | Agar Scientific | T585 | Or any equilavent product |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | Or any pliable surface |
| Testtube rack | Fisherbrand Derlin | 10257963 | Or any equilavent product |
| Pressure myography | |||
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | x2 (or any equilavent product) |
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Analysis software | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
| Analysis plugin | Myotraker | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 | Custom plugin for imageJ Freely available for download |
| Cannulation pipette glass | World Percision instruments | TW150F-4 | Or any equilavent product |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| Fluo-4-AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Make 1 mM stock in DMSO |
| Forceps | World Precision Instruments | Dumont #7 14097 | Any equivalent fine forceps |
| Fura-2-AM | Thermo Fisher Scientific | F1221 | Make 1 mM stock in DMSO |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| Helper pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
| Manometer | Riester | LF1459 | Or any equilavent product |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
| Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
| Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W558818 | 75μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Or any equilavent product |
| USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
| Video capture software | Hypercam | version 2.28.01 | Or any equilavent product |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Patch clamping | |||
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve) |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200a | Or any equilavent product |
| Analogue digital converter | Axon | Digidata 1440A | Or any equilavent product |
| Collagenase Type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | 0.1mg/mL in LCH |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| DNAse I | Millipore | 260913 | Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) |
| Faraday cage | Custom made | Any equilavent commerical product | |
| Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
| Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
| Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Patching software | Molecular Devices | Pclamp v10.2 | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
| Protease Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | 0.01mg/mL in LCH |
| Single channel pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
| USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| Whole cell pipette glass | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Or any equilavent product |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
| x40 lens | Nikon | 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 | Or any equilavent product |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Ca2+ imaging | |||
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
| Acquisition software | Cairn Research Ltd. | Acquisition Engine V1.1.5 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Analysis software for confocal imaging | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Confocal microscope | Leica Geosystems | SP5 | Or any equilavent product; confocal |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Monochromator | Cairn Research Ltd. | Optoscan | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Software for confocal microscope | Leica Geosystems | LAS-AF version 3.3. | Or any equilavent product; confocal |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| x100 lens | Nikon | x100 N.A. 1.3 oil | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x20 lens | Leica Geosystems | HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D | Or any equilavent product; confocal |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x4 lens | Leica Geosystems | C PLAN, 4x/0.10, ∞/-/✝ | Or any equilavent product; confocal |
| x63 lens | Leica Geosystems | HCX PL APO, 63x/1.40 – 0.60 OIL CS ∞/0.17/E | Or any equilavent product; confocal |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Pipettes | Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation | ||
| Helper pipette | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >10 MΩ |
| Cannulation pipette | World Percision instruments | TW150F-4 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 290 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 58 Time: 150 No of cycles: 4 Tip diameter: 3-10 μm Polishing: no Final Resistance: <1 MΩ |
| On-cell patching | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >5 MΩ |
| Whole-cell patching | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 296 Pressure: 200 Heat: 287 Pull : 0 Velocity: 50 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 2-3 μm Polishing: helpful but not necessary Final Resistance: 1-2 MΩ |
Referências
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Citar este artigo
Curtis, T. M., McLaughlin, D., O’Hare, M., Kur, J., Barabas, P., Revolta, G., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., McGahon, M. K. Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies. J. Vis. Exp. (137), e57944, doi:10.3791/57944 (2018).