Kjemisk hjemfall til konvensjonelle menneskelige Pluripotent stamceller til en naiv-lignende tilstand med forbedret Multilineage differensiering styrke
Summary
Vi presenterer en protokoll for effektiv, bulk og rask kjemiske hjemfall til konvensjonelle avstamning-primet menneskelige pluripotent stamceller (hPSC) i en epigenomically-stabil naive preimplantation epiblast-lignende pluripotent tilstand. Denne metoden resulterer i redusert avstamning-primet genuttrykk og markert forbedring i regissert multilineage differensiering over et bredt repertoar av konvensjonelle hPSC linjer.
Abstract
Naive menneskelige pluripotent stamceller (N-hPSC) med forbedret funksjonalitet kan ha en bred innflytelse i regenerativ medisin. Målet med denne protokollen er effektivt gå avstamning-primet, konvensjonell menneskelige pluripotent stamceller (hPSC) vedlikeholdes på enten mater-fri eller mater-avhengige betingelser som en naiv som pluripotency med forbedret funksjonalitet. Denne kjemiske naiv hjemfall metoden bruker den klassiske leukemi hemmende faktoren (LIF), GSK3β, og MEK/ERK hemming cocktail (LIF-2i), med bare en tankyrase hemmer XAV939 (LIF-3i). LIF-3i tilbakestilles konvensjonelle hPSC til en stabil pluripotent tilstand vedta biokjemiske, transcriptional og epigenetic funksjoner av den menneskelige før implantasjon epiblast. Denne LIF-3i metoden krever minimal celle kultur manipulasjon og er svært reproduserbare i et bredt repertoar av menneskelige embryonale stamcelleforskningen (hESC) og transgene uten menneskelig indusert pluripotent stamceller (hiPSC) linjer. Metoden LIF-3i krever ikke et nytt grunning skritt før differensiering; N-hPSC kan være differensiert direkte med ekstremt høy effektivitet og opprettholde karyotypic og epigenomic stabilitet (inkludert på trykt loci). For å øke universalitet metoden, konvensjonelle hPSC er første kultivert i LIF-3i cocktail med to flere små molekyler som forsterke protein kinase en (forskolin) og soniske pinnsvin (SSH) (purmorphamine) signalering (LIF-5i). Dette korte LIF-5i tilpasning trinnet vesentlig forbedrer første klonal ekspansjon av konvensjonelle hPSC og tillater dem å være senere naiv-tilbake med LIF-3i alene i bulkmengder, så obviating behovet for plukking/subcloning sjeldne N-hPSC kolonier senere. LIF-5i-stabilisert hPSCs vedlikeholdes senere i LIF-3i alene uten behovet av anti-apoptotisk molekyler. Viktigst, forbedrer LIF-3i hjemfall markert den funksjonelle pluripotency av et bredt repertoar av konvensjonelle hPSC ved å redusere deres slektslinje-primet genuttrykk og slette interline variasjon av rettet differensiering vanligvis observert blant uavhengige hPSC linjer. Representant characterizations av LIF-3i-vende N-hPSC er angitt, og eksperimentell strategier for funksjonell sammenligninger av isogenic hPSC i avstamning-primet vs. naive som stater er beskrevet.
Introduction
2i (MEK/ERK og GSK3β inhibitor) kultur-systemet ble opprinnelig utviklet for å avgrense heterogene serum-baserte mus embryonale stamceller (mESC) kulturer til en jevn bakken tilstand av pluripotency som musen preimplantation epiblast1. 2i støtter imidlertid ikke stabil vedlikehold av menneskelig pluripotent stamceller (hPSC) linjer2. De ulike komplekse små molekyl, vekst faktor-supplert, og transgene tilnærminger har nylig rapportert å fange åpenbart ligner menneskelige naiv som pluripotent molekylær sier2. Men mange av “naive-like” delstater som er opprettet med disse også utstilt karyotypic ustabilitet, epigenomic feil (f.eks globale tap av foreldrenes genomisk preging) eller svekket differensiering potensielle.
I kontrast, cocktail av trippel kjemiske hemming av GSK3β, ERK og tankyrase signalene og leukemi hemmende faktor (LIF-3i) var tilstrekkelig for den stabile naiv som hjemfall av et bredt repertoar av konvensjonelle hPSC linjene3. LIF-3i-vende naive hPSC (N-hPSC) beholdt normale karyotypes og økt deres uttrykk av naiv-spesifikke menneskelig preimplantation epiblast gener (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i hjemfall også gitt en hPSC med et utvalg av molekylære og biokjemiske egenskaper som er unike for mESC-lignende naiv pluripotency som inkludert økt fosforylert STAT3 signalnettverk, redusert ERK fosforylering, globale 5-methylcytosine CpG hypomethylation, genomet hele CpG demethylation på embryonale stamcelleforskningen (ESC)-spesifikke genet arrangører og dominerende distale OCT4 enhancer bruk. Videre i forhold til andre naiv hjemfall metoder som resulterte i aberrantly hypomethylated trykt genomisk loci, LIF-3i-vende N-hPSC ble blottet for systematisk tap av trykt CpG mønstre eller tap av DNA methyltransferase uttrykk (f.eks DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
En direkte LIF-3i kultur for et bredt spekter av konvensjonelle menneskelige embryonale stamceller (hESC) og menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSC) dyrket på matere eller E8 mater-gratis forhold oppnådd rask og bulk hjemfall til en naiv epiblast-lignende tilstand. Direkte LIF-3i naiv hjemfall kan imidlertid være ineffektiv i noen ustabil konvensjonelle hPSC linjer på grunn av de iboende genomisk og avstamning-fylt variabilities som oppstår fra genetisk ulike donor bakgrunn.
Dermed for å utvide nytten av metoden LIF-3i, en gradvis optimalisering utviklet og presenteres her, som gjør universell naiv hjemfall med nesten alle konvensjonelle hESC eller transgene-fri hiPSC linje kultivert på matere. Denne universalized naiv hjemfall metoden bruker et forbigående første kultur skritt i konvensjonelle hPSC som supplerer LIF-3i cocktail med to flere små molekyler (LIF-5i) som forsterke protein kinase en (forskolin) og () soniske pinnsvin (SSH) purmorphamine) signalering. En første passering av konvensjonelle hPSC i LIF-5i tilpasser dem til etterfølgende stabil LIF-3i hjemfall i bulkmengder. Første LIF-5i tilpasning betydelig forsterker første enkelt celle klonal spredning av konvensjonelle hPSC dyrket på E8 eller matere (før deres påfølgende stabil, sammenhengende passasje i LIF-3i alene). Konvensjonelle hPSC linjer tilpasset først tolerere til en passasje i LIF-5i påfølgende bulk klonal passaging naiv-vende celler i LIF-3i forhold, som obviates behovet for plukking og subcloning av de sjeldne stabile koloniene eller rutinemessig bruk av anti-apoptotisk molekyler eller Rho-assosiert protein kinase (ROCK) hemmere.
Metoden LIF-3i har vært vellykket ansatt stabilt utvide og vedlikeholde et bredt repertoar av > 30 uavhengig, genetisk ulike konvensjonelle hPSC linjer for > 10-30 passasjer med enten ikke-enzymatisk eller enzymatisk dissosiasjon metoder og uten bevis for induksjon av chromosomal eller epigenomic avvik, inkludert unormalt på trykt genet loci. I tillegg sekvensiell LIF-5i/LIF-3i kultur er bare naiv hjemfall metoden som hittil er rapportert som forbedrer den funksjonelle pluripotency av et bredt repertoar av konvensjonelle hPSC linjer ved å redusere deres slektslinje-primet genuttrykk og dramatisk forbedrer deres multipotent differensiering styrke. LIF-3i naiv hjemfall metoden sletter iboende interline variasjon av avstamning-primet, konvensjonell hPSC linjer, og har en stor nytte av programmet i regenerativ medisin og mobilnettet terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
LIF-3i systemet bruker en modifisert versjon av den klassiske murine 2i naiv hjemfall cocktail1 menneskelige pluripotent stamceller. Self-fornyelse av hPSC (som ikke utvide i 2i alene) stabiliseres i LIF-2i ved supplere denne cocktail med tankyrase hemmer XAV939. LIF-3i kultur kan bulk og effektiv hjemfall til den konvensjonelle hPSC til en pluripotent tilstand ligner menneskelige preimplantation epiblast3. Selv om virkningsmekanismer av XA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, den Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award og Moseley stiftelsen.
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referências
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
- Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
- Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
- Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
- Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
- Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
- Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
- Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
- Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
- Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
- Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
